فصل 1

مقدمه ای بر هيستولوژی [1]

بافت شناسی عبارتست از مطالعه میکروسکوپی بافتهای طبیعی بدن، در حالیکه هیستوپاتولوژی عبارت از مطالعه میکروسکوپی بافتهایی که تحت تأثیر بیماریها قرار گرفته‌اند می باشد.

روشهای اختیار شده برای تهیه نمونه برای چنین مطالعاتی بعنوان تکنیکهای هیستولوژی یا هیستوپاتولوژی شناخته شده و این تکنیکهاست که در اولین مرحله تکنسینهای بخش با آنها کار می کنند.

روشهای مختلف تهیه و آزمایش گسترشها، نگهداری و عمل آوردن بافتها, برش و رنگ آمیزی مقاطع و توانایی تشخیص یا روشهای تهیه، مهارت متخصصین آزمایشگاه را در این زمینه تشکیل می دهد.

برای انجام صحیح این مراحل شناخت دقیق ساختمان سلول و ارگانها و بافتهای تشکیل دهنده آنها ضروری است.

ماده اصلی تمام موجودات زنده پرتوپلاسم است که این در مقیاس کوچک سلول نامیده می شود. پرتوپلاسم یک اسم عام برای قسمتهای تشکیل دهنده سلول (حالت کلوئیدی) همراه با آب، پروتئین کربوهیدرات، چربیها و نمکهای غیر آلی است.

در صورتیکه سلول بوسیله روشهای هیستولوژی و میکروسکوپ نوری مطالعه شود شبیه شکل شماره 1 دیده می شود.

در مطالعه توسط میکروسکوپ الکترونی ساختمانهای کاملاً لوله ای شکل در سیتوپلاسم و جزئیات داخل هسته دیده می‌شود که توسط میکروسکوپ نوری قابل روئیت نیست (شکل2).

سلول

بطور ساده یک سلول ممکن است بعنوان یک توده پرتوپلاسمی توضیح داده شود که داخل یک غشاء[2] احاطه شده و شامل یک هسته[3]  است که توسط غشاء هسته محصور شده است. قسمتی از سلول که بین غشاء سلول و غشاء هسته قرار می گیرد سیتوپلاسم[4] نامیده می شود. در داخل سیتوپلاسم یک گروه ساختمانهای کوچک به نام ارگانل[5] ممکن است تشخیص داده شود. كه اینها ساختمانهای اختصاص یافته با اعمال خاص بوده و شامل اجزاء زنده سلول هستند (شکل1).

غشاء سلول

یک غشاء نیمه تراواست که اجازه عبور انتخابی مواد را بداخل یا خارج سلول می دهد. تبادل مواد از غشاء سلول تحت تأثیر فشار اسمزی مایع بین سلولی[6] و مواد داخل سیتوپلاسم و یا انتقال فعال[7] صورت می گیرد.مطالعه توسط میکروسکوپ الکترونی نشان می دهد که این غشاء شامل سه لایه است که از مولکولهای پروتئین و چربی تشکیل شده است.

ارگانلهای سیتوپلاسمی[8]

1- شبکه اندوپلاسمی[9]

سیتوپلاسم توسط شبکه ای از لوله های شاخه ای ریز به نام شبکه اندوپلاسمی (E.R) نظم پیدا می کند. این لوله ها توسط یک غشاء پوشیده شده وروی آن دانه های ریبونوکلئوپروتئین ریبوزوم[10] قرار می گیرند که اینها به نام شبکه اندوپلاسمی زبر یا دانه دار[11] نامیده می شوند که در ارتباط با سنتز پروتئین هستند. قسمتی از شبکه اندوپلاسمی که فاقد این دانه هاست به نام شبکه اندوپلاسمی صاف یا غیردانه دار[12] گفته می شوند.

 و حدس زده می شود که در بعضی سلولها اینها در ارتباط با سنتز چربی ها و مواد مشابه هستند. اگرچه شبکه اندوپلاسمی توسط میکروسکوپ نوری قابل روئیت نیست ولی با توجه به مقدار آنها در سیتوپلاسم اثراتی در رنگ آمیزی مشاهده می شود.

 

2- دستگاه گلژی[13]

یک قسمت اختصاص یافته از شبکه اندوپلاسمی بدون دانه است که دارای کانالهای غشایی و واکوئل بوده که ممکن است توسط واکنشهای خاص با نمکهای نقره یا تتراکسید اسمیوم مشخص شوند. مواد مترشحه در اطراف این ناحیه جمع شده و احتمالاً توسط ترکیبات کربوهیدرات بسته بندی می شوند.

3- میتوکندری[14]

این اجسام رشته ای یا دانه ای کوچک ممکن است بطور یکنواخت در تمام سیتوپلاسم پخش شده و یا بسته به نوع سلول در یک ناحیه خاص جمع شوند.

تعداد میتوکندری ها ممکن است خیلی زیاد باشد، بطوریکه در سلولهای کبدی به 2500عدد می رسد. طول میتوکندری ها بیش از 7میکرون و عرض آنها بین 5/0 تا 1 میکرون متغیر است. اینها در سلولهای تازه فیکس نشده، بوسیله تکنیکهای خاص میکروسکوپی و يا در سلولهای فیکس و رنگ آمیزی شده می توانند دیده شوند. در زیر میکروسکوپ الکترونی این ارگانلها دارای یک غشاء دو لایه بوده که داخلی ترین لایه در سرتاسر میتوکندری روی هم چین خورده و در چندین نقطه تشکیل قسمتهای طاقچه مانند را می دهد که تجمع و شکل این قسمتها در سلولهای مختلف با توجه به فعالیت آنها متفاوت است.

میتوکندری ها بعنوان مراکز قدرت سلول شناخته شده و ظاهراً در ارتباط با تنفس و فعالیت آنزیمی سلول هستند. اینها سریعاً تحت تأثیر اتولیز[15] قرار گرفته و تقریباً جزء اولین ساختمانهایی هستند که بعد از مرگ سلول ناپدید می شوند.

اسید استیک چون باعث تخریب و تغییر شکل میتوکندری می شود در محلولهای فیکس کننده نباید بکار برود.

4- لیزوزم[16]

ارگانل های کوچک کروی شکل با قطر حدود 25/0 میکرون هستند.

لیزوزمها توسط یک غشاء احاطه شده و دارای آنزیم های هیدرولیز کننده که مولکولهای پیچیده بزرگ را به مولکولهای کوچکتر تجزیه می کنند، می باشد. پاره شدن غشاء لیزوزم و خارج شدن آنزیم ها باعث تخریب بعدی سلول شده که این عمل اتولیز نامیده می شود.

لیزوزمها در لوکوسیتها و ماکروفاژها که نقش مهمی در فاگوسیتوز[17] یا هضم داخل سلولی باکتریها و ذرات غذایی دارند، به مقدار زیاد دیده می شود.

5-  سانتروزوم[18]

مرکز سلول یا سانتروزوم در تمام سلولها وجود داشته، اگرچه بجز در حین تقسیم سلولی بسهولت دیده می شود. این بصورت یک ناحیه روشن[19] بقطر کمتر از یک میکرون در سیتوپلاسم دیده می شود. اغلب در قسمت تقعر هسته قرار گرفته و شامل دو نقطه تیره به نام سانتریول[20] است.

میکروسکوپ الکترونی نشان می دهد که سانتریولها اجسام استوانه ای شکل بوده که دیواره آنها از الیاف ظریفی تشکیل شده که به صورت طولی شبیه یک دسته ترکه[21] در کنار یکیدیگر قرار می گیرند. تصور می شود که سانتریولها در ارتباط با ساختن مواد رشته ای شکل از قبیل مژکها[22] هستند که به صورت زوائد مو مانندی از بعضی سلولها کشیده شده و با دوک الیاف که در موقع تقسیم کروموزمها در حین تقسیم ایجاد می شود، ارتباط دارند.

اینکلوژنهای سیتوپلاسمی[23]

مواد غیر زنده ای که ممکن است در سیتوپلاسم سلولها دیده شوند اینکلوژن گفته می شوند، که معمولا شامل مواد غذایی ذخیره شده، مواد تولید شده توسط سلول ، یا مواد خورده شده هستند آنهایی که معمولا بیشتر دیده می شوند عبارتند از :

1- گلیکوژن[24]

تجمع گلیکوژن در سیتو پلاسم سلولهای کبدی و عضلات مخطط است.

در مقطع رنگ آمیزی شده بصورت دانه های ریز یا یک توده بزرگ بی شکل دیده  می شود.

2- چربی[25] 

چربی معمولاً در سلولهای چربی ذخیره می شود، ولی ممکن است بطور طبیعی

 یا پاتولوژیک در سایر سلولها نیز دیده شود. چربی بصورت تجمع گلبولهای کوچکی بوده که به یکدیگر فیوز شده و تشکیل گلبولهای بزرگ را می دهند که اغلب تمام سیتوپلاسم را اشغال کرده و هسته را به یک سلول جابجا می کنند.

در موقع تهیه مقطع به روش پارافین یا سلوئیدین چربی حل و خارج می شود مگر از مواد فیکس کننده خاص استفاده شود، ولی در روش مقاطع یخی به آسانی نشان داده می شود.

 

3- ذرات ترشحی[26]

اینها شامل تولیدات سلول بوده که در سیتوپلاسم سلولهای خاصی نقش ترشحی دارند دیده می شود. اینها بصورت گلبولهای کوچک در تمام سیتوپلاسم پراکنده که در مرحله فیکس کردن منعقد شده و بصورت دانه ای در می آیند.

4- رنگدانه[27]

اینها به مقدار زیاد در سیتوپلاسم سلولها دیده می شوند که ممکن است منشاء خارجی[28] یا داخلی[29] داشته باشند.

رنگدانه های با منشاء داخلی مثل ملانین و هموسیدرین در داخل بدن ساخته شده و رنگدانه های خارجی ذرات مواد خارجی مثل خاکه ذغال Coal dust  هستند که فاگوسیتوز شده و هضم می شوند.

رنگدانه های مصنوعی در اثر فیکس کردن یا رسوب مواد رنگی ممکن است بوجود آیند که به آسانی از رنگدانه های طبیعی قابل تشخیص می باشند.

هسته[30]

بطور کلی هسته شامل قسمتهای زیر می باشد:

 1- غشاء هسته[31]

هسته داري بيشتر مواد ژنتيكي سلول است كه توسط دو غشاء شبيه غشاء سلول احاطه مي شوند.

 

2- كروماتين[32]

تجمع مواد متمايل به رنگهاي بازي در تمام هسته پراكنده است كه اينها بعنوان دانه هاي كروماتيني شناخته مي شوند.

شدت واكنش رنگي اين دانه ها و كروموزمها كه در حين تقسيم سلولي ديده مي شوند مربوط به محتواي نوكلئوپروتئيني آنهاست.

نوكلئوپروتئين شامل پروتئينهاي بازي و اسيد نوكلئيك است كه اسيد نوكلئيك  اصلي موجود در كروماتين دي اكسيد ريبوز نوكلئيك اسيد (DNA) است.

3- هستك[33]

يك جسم كروي شكل است كه در هسته اغلب سلولها ديده مي شوند كه شامل مقدار زيادي ريبونوكلئيك اسيد (RNA) بوده و احتمالاً در ارتباط با سنتز پروتئينهاست.

4- كروموزمها[34]

اجسام رشته اي شكل بوده كه در حين تقسيم سلولي در هسته ديده مي شوند.

هر كروموزم يك ساختمان شكاف خورده اي دارد كه بوسيله دو كرماتيد كه در كنار يكديگر قرار مي گيرند و در يك نقطه به نام سانترومر به يكديگر متصل مي شوند، تشكيل مي شود.

سلولهاي طبيعي بدن انسان (غير جنسي) داراي 46 كروموزم است كه بصورت جفتي قرار دارند، هر يك از اينها از پدر و مادر منشاء مي گيرد كه بعلت اين حالت جفتي بعنوان ديپلوئيد گفته شده كه شامل يك جفت كروموزم جنسي و 22 جفت كرومزم غير جنسي[35] است. كروموزمهاي جنسي در ماده شبيه يكديگر و بصورت XX نشان داده شده در حاليكه در نر مشابه و بصورت XY هستند.

سلولهاي جنسي بالغ نر و ماده به نام اسپرم و تخمك فقط داراي يكسري كروموزم بوده كه بصورت هاپلوئيد مي باشند.

در انسان كروموزمهاي تخمك شامل 22 كروموزم اتوزوم و يك كروموزم X و كروموزمهاي اسپرم شامل 22 اتوزوم و يك كروموزم جنسي X يا Y است.

در اثر تلاقي اسپرم و تخمك كروموزمها بصورت ديپلوئيد شده و جنسيت جنين توسط كرموزم جنسي اسپرم تعيين مي شود.

تقسيم سلولي[36]

 

عملي كه بوسيله آن اغلب سلولهاي بدن تقسيم مي شوند ميتوز[37] ناميده مي شود.

قبل از اينكه تقسيم سلولي اتفاق بيافتد مقدار DNA هسته دوبرابر شده بطوريكه نيمي از آن به هر يك از سلولهاي جديد منتقل مي شود.

چهار مرحله در تقسيم ميتوز مشخص شده اگر چه تمام اين مراحل بطور مداوم و پشت سر هم انجام شده و هيچ فاصله اي در بين مراحل وجود ندارد.

پروفاز[38]

كروموزم هاي هسته بصورت يك توده درهم پيچيده رشته اي جمع شده و بعد بصورت كروموزمهاي جفت جدا مي شوند. در اين ضمن سانتريولها جدا شده و به دو قطب سلول حركت كرده و هر يك يكسري الياف نازك به نام Achromatic spindle را درطول با خودكشيده وجفتهاي كروموزمها رادرجاي خود قرار مي دهند.

هسته و غشاء هسته ناپديد شده و تا زماني كه تقسيم بطور كامل انجام گيرد، ديده نمي شوند.

متافاز[39]

كروموزمها در ناحيه استوايي و Achromatic spindle قرار گرفته و هر يك بطور طولي بدو كروماتيد تقسيم مي شود.

آنافاز[40]

سانتريولها به كنار حركت كرده و كروماتيدهاي هر كروموزم در امتداد دوك حركت نموده و از يكديگر دور شده و در دو قطب سلول قرار مي گيرند، در اين حالت سلول داراي دو سري كروموزم مجزاست و غشاء سلول شروع به جمع شدن مي كند.

تلوفاز[41]

در اين آخرين مرحله تقسيم ميتوز هر يك از دو گروه كروموزم توسط

 غشاء سيتوپلاسمي احاطه شده و دوباره بصورت كلاف درهم پيچيده شده و دانه هاي كروماتيني ظاهر مي شود.

غشاء سلول جمع شدن را ادامه داده و در نهايت تقسيم مي شود و دو سلول دختر از يكديگر جدا شده و بصورت جداگانه شبيه سلولهاي والدين شكل مي گيرند. (شكل3)

 

 مواد بين سلولي[42]

سلولهاي زنده توسط مواد غير زنده اي به نام مواد بين سلولي به يكديگر متصل شده و بافتها را بوجود مي آورند.

بعضي بافتها اساساً از يك نوع سلول تشكيل شده اند كه عمل اصلي آن بافت را انجام داده ولي بيشتر بافتها علاوه بر اين، داراي تعدادي سلول هستند كه اين سلول هاي تخصيص يافته را محافظت مي كنند. مواد بين سلولي شامل مايع بافتي و الياف مختلف است كه اساساً شامل الياف كولاژن، الاستيك و رتيكولر است. اعمال اين مواد نگهداري و محافظت بافت يا نگهداري و تغذيه سلولهايي است كه اطراف آنها قرار مي گيرند.

كولاژن[43]

يك پروتئين محكم رشته اي شامل الياف ريزي به قطر 3/0 تا 5/0 ميكرون بوده كه در كنار يكديگر قرار گرفته و اليافي كه بوسيله ميكروسكوپ قابل روئيت هستند و نوارهايي به ضخامت 100 ميكرون را بوجود مي آورند.

اين الياف گاهي به نام الياف سفيد شناخته مي شوند كه اينها از مواد مشخصه تمام بافتهاي همبند هستند.

الياف الاستيك[44]

اينها شمال پروتئين رشته اي الاستين بوده و بصورت رشته يا نوارهاي شاخه شاخه يكنواختي هستند كه از الياف كولاژن خيلي نازكترند و بعنوان الياف زرد شناخته مي شوند. عمل اينها طوري است كه خاصيت ارتجاعي به بافت داده و وقتي تعدادشان زياد شود رنگ بافت را تغيير مي دهند.

اين الياف به مقدار زيادي در ديواره عروق خوني، ناي، ريه و درميس وجود دارد. 

الياف ريتكولر[45]

از نظر ساختماني شبيه الياف كولاژن است و اغلب با آنها متصل مي باشد با اين تفاوت كه بطور خاصي تظاهر يافته و شبكه ظريفي را براي نگهداشتن سلولها، مويرگها و الياف عصبي بوجود آورده و همچنين در محل اتصال بافت همبند با ساير بافتها نيز ديده مي شوند.

 

دسته بندی : تهیه مقطع

فصل 11

محلول سازی و فورمولها

محيط هاي مايي

شربت كارو كورن[1]

فرمول :

شربت كاروكورن ( شفاف)                    1 حجم

آب مقطر                                  2 حجم

تيمول به عنوان نگهدارنده                 1 كريستال

روش تهيه

شربت ذرت را با آب مقطر رقيق كرده و تيمول را اضافه كنيد. خوب مخلوط نموده، برچشب زده و در يخچال 4 درجه نگهداري كنيد.

 

شربت فروكتوز[2]

فرمول:

فروكتوز                                   70 گرم

آب مقطر                                   20 ميلي ليتر

روش تهيه  

فروكتوز را در آب مقطر در حرارت 37 درجه براي 24 ساعت حل كرده، مخلوط نموده و برچسب بزنيد.

محيط فارانت[3]

فرمول:

صمغ عربي                                  50 گرم

آب مقطر                                   50 ميلي ليتر

گليسرول                                   50 ميلي ليتر

تري اكسيد آرسنيك به عنوان نگهدارنده        1 گرم

روش تهيه

صمغ عربي را بوسيله حرارت مختصر در آب مقطر حل كنيد، گليسرول و تري اكسيد آرسنيك را اضافه نموده، خوب همزده و بر چسب بزنيد.

توجه :

a) بجاي نوع اسيدي با 4/4 = PH با اضافه كردن 50 گرم استات پتاسيم به محلول فوق يك محيط خنثي با 2/7 = PH  و 44/1 = R . I بوجود مي آيد.

 b) موتيولات سديم 025/0 درصد ممكن است با مزايايي بجاي تري اكسيد آرسنيك اضافه شود.

ژل گليسرين[4]    

فرمول:

ژلاتين                                         10 گرم

گليسرول                                      70 ميلي ليتر

آب مقطر                                      60 ميلي ليتر

كريستال فنل به عنوان نگهدارنده               25/0 گرم

روش تهيه

ژلاتين را وزن نموده و در آب مقطر ريخته و در حرارت 60 درجه بگذاريد تا محلول برسد، گليسرول و بعد كريستالهاي فنل را اضافه كرده، خوب هم بزنيد، برچسب زده و در يخچال 4 درجه نگهداري كنيد.

آماده كردن براي استفاده

ژل گليسرين را در حمام آب گرم يا انكوباتور 60 درجه ذوب كنيد.

توجه: براي جلوگيري از ايجاد حباب هوا در محلول مونت كننده از تكان دادن و هم زدن محيط ذوب شده قبل از استفاده اجتناب شود.

مونت كننده هاي رزيني

بالزام خنثي[5]

روش تهيه:

كانادا بالزام را در زيلن حل كرده تا يك محلول نسبتا رقيق ( 40 تا 50 درصد) تشكيل شود. كربنات كلسيم به ميزان زيادي اضافه نموده و كاملا هم بزنيد.

اجازه دهيد تا مخلوط ته نشين شود، مايع رويي را در شيشه ذخيره ريخته و باقيمانده را دور بريزيد. تاريخ و برچسب را ثبت كنيد.

توجه:  a) در صورتيكه در انكوباتور 37 درجه يا آون پارفين 58 درجه قرار گيرد كانادا بالزام به سرعت در زيلن حل مي شود.

b) ممكن است به جاي زيلن از تولوئن به عنوان حلال استفاده شود.

c) كانادا بالزام يك رزين طبيعي است كه از Abies balsamea تهيه مي شود. مونت كرننده تهيه شده از اين رزين فقط به صورت موقت مي تواند خنثي باشد، در اثر نگهداري اسيدي و قهوه اي مي شود.

بالزام اسيدي[6]

روش تهيه:

كانادا بالزام را در زلين حل كرده تا يك محلول نسبتا رقيق ( 40 تا 50 درصد) تهيه شود. تا حد زيادي اسيد ساليسيليك اضافه نموده و كاملا هم بزنيد. اجازه دهيد تا مخلوط ته نشين شود، مايع رويي را در شيشه هاي ذخيره ريخته و بقيه ا دور بريزيد. تاريخ و برچسب را ثبت كنيد.

توجه : مثل قبلي

زيلين دمشقي [7]

روش تهيه :

يك محلول رقيق از صمغ دمشقي بوسيله حل كردن در كلروفرم تهيه كنيد.

با استفاده از فشار منفي توسط يك كاغذ صافي، در قيف بوخنر فيلتر كرده و فيلتر را تبخير كنيد تا زماني كه تمام كلروفرم از بين برود، صمغ خالص شده را در زيلن حل تا محلول مناسب بدست آيد ( تقريبا 60 درصد ) تاريخ و برچسب را ثبت كنيد.

توجه :  a) صمغ دمشقي يك رزين طبيعي است كه از درخت Sherea Wiesneri در هند شرقي بدست مي آيد. محصول تجارتي داراي مقادير زيادي ناخالصي است كه قبل از استفاده بايستي خالص شود.

b) مثل كانادابالزام نبايد در موقع نگهداري قهوه اي شود.

رزينهاي مصنوعي

تعداد زيادي محيطهاي مونت كردن از رزينهاي مصنوعي به صورت تجارتي در دسترس هست. فرمول اكثر اين محيط ها سري است ولي عموما بوسيله حل كردن يك پلي استيرن در يك حلال هيدروكربن آروماتيك تهيه شده و يك ماده پلاستيكي مانند دي بوتيل فتالات يا فسفات تري كرزول از تشكيل جباب هوا در موقع خشك شدن آنها جلوگيري مي كند.

 

محيط DPX [8]

ديسترن 80                                      10 گرم

دي بوتيل فتالات                                 5 ميلي ليتر

زيلن                                          35 ميلي ليتر

روش تهيه:

در بويل فتالات را با زيلن مخلوط كرده، هم زده و ديسترن 80 درصد را حل كنيد. تاريخ و برچسب را ثبت كنيد.

توجه: براي برداشتن لامل از روي مقطع مونت شده آن را در تري كلر اتيلن غوطه ور كنيد.

مقطع مونت شده توسط DPX بايستي در زيلن عاري از پارافين شفاف شود.

روشهاي از بين بردن رنگدانه ها

روش از بين بردن رسوب كلريد جيوه

محلول لوگول آيودين

محلول 1: يديد پتاسيم                             2 گرم

 يد                                             1 گرم

آب مقطر                                       100 گرم

محلول 2: تيوسولفات سديم                          5 گرم

آب مقطر                                      100 ميلي ليتر

روش تهيه :

محلول 1: يديد پتاسيم را در آب مقطر حل كرده و سپس يد را اضافه نموده تاريخ و برچسب را ثبت كنيد.

محلول 2: تيوسولفات سديم را در آب مقطر حل كرده، هم زده و برچسب بزنيد.

روش كار:

1- مقطع را در آب قرار دهيد.

2- براي 10 دقيقه در محلول شماره يك غوطه ور نماييد.

3- با آب بشوئيد.

4- براي 5-3 دقيقه در محلول شماره 2 بشوئيد.

5- كاملا در آب شستشو دهيد.

6- روش رنگ آميزي مورد نظر را انجام دهيد.

روش شريد[9]

براي از بين بردن رنگدانه هاي فرمالين بعد از مرگ:

فرمول:

آمونيا ( وزن مخصوص 880/0 )                  1 ميلي ليتر

اتانل 75 درصد                            200 ميلي ليتر

روش كار:

1- مقطع را در الكل 70 درصد قرار دهيد.

2- توسط الكل آمونياكي براي 30 دقيقه شستشو دهيد.

3- كاملا در آب جاري بشوئيد.

4- روش رنگ آميزي مورد نظر را ادامه دهيد.

روش وروكاي[10]

براي از بين بردن رنگدانه فرمالين پس از مرگ

فرمول:

هيدروكسيد پتاسيم 1 درصد ( محلول مايي)             1 ميلي ليتر

اتانل 80 درصد                                  100 ميلي ليتر

روش كار:

1- مقطع را در الكل 80 درصد بگذاريد.

2- در محلول هيدروكسيد الكلي براي 10 دقيقه شستشو دهيد.

3- توسط دو تعويض اب شستشو دهيد.

4- براي 5 دقيقه به الكل 80 درصد منتقل كنيد.

5- در آب شستشو دهيد.

6- روش رنگ آميزي مورد نظر را انجام دهيد.

 

اسيد پيكريكالكلي بارت[11]

براي از بين بردن رنگدانه فرمالين پس از مرگ:

1- توسط زيلن مقطع را عاري از پارافين كرده و كاملا در الكل مطلق بشوئيد.

2- براي 30 دقيقه يا بيشتر در اسيدپيكريت الكلي اشباع ( تقريبا 5/8 درصد) قرار دهيد.

3- در الكل مطلق شستشو دهيد تا اسيد پيكريك خارج شود.

4- مقطع را در آب قرار دهيد و رنگ آميزي را به روش معمول ادامه دهيد.

محلول هماتوكسيلين براي رنگ آميزي هسته سلول

ماده افزاينده رنگ[12] كه همراه هماتوكسيلين براي نشان دادن هسته و اجزاء سيستوپلاسم بكار مي رود، زاج سفيد[13] و آهن است. محلول حاوي زاج سفيد هسته را به صورت آبي شفاف رنگ كرده كه سريعا در حضور اسيد به قرمز تبديل مي شود و محلول حاوي زاج سفيد هسته را به صورت آبي شفاف رنگ كرده كه سريعا در حضور اسيد به قرمز تبديل مي شود و محلول حاوي آهن هسته را به صورت خاكستري – سياه تيره رنگ كرده و كمتر به اسيد حساس است.

هماتوكسيلين – آهن وقتي كه رنگ زمينه[14] خاصيت اسيدي قوي دارد، خيلي ارزشمند است. همچنين در مواردي كه جزئيات ساختمانهاي ريز هسته و سيتوپلاسم مورد توجه باشند، بكار مي رود.

محلول هماتوكسيلين – زاج سفيد

تعداد زيادي از محلولهاي هماتوكسيلين كه حاوي زاج سفيد هستند، ساخته شده اند ولي فقط سه تا از آنها بطور معمول استفاده مي شوند.

هماتوكسيلين- زاج سفيد به عنوان يك رنگ معمولي همراه با ائوزين براي نشان دادن ساختمان كلي بافت بكار مي رود.

محلول هماتوكسيلين – آهن

دومحلول هماتوكسيلين– آهن براي كارمعمول درآزمايشگاه بكارمي روند هيدن هاين[15] و ويگرت[16]. از اين دو،ويگرت برتري داشته چون رنگ خيلي سريعي است و در كارهاي آسيب شناسي كه زمان فاكتور مهمي بشمار مي آيد، حائز اهميت است. معمولا براي رنگ آميزي هسته در مقاطعي كه رنگ زمينه شان براي نشان دادن الياف كولاژن ، وان گيسون[17] است، بكار مي رود همچنين رنگ معمول براي نشان دادن تخطط[18] در الياف عضلاني بوده و براي رنگ آميزي قارچ در مقاطع مورد استفاده قرار مي گيرد.

روشها و نتايج

هماتوكسيلين- زاج سفيد اسيدي ماير و ائوزين

يك روش رنگ آميزي معمولي است.

هماتوكسيلين – زاج سفيد اسيدي ماير

محلول شماره 1:

زاج سفيد آمونياكي                 50 گرم

كلرال هيدرات                     50 گرم

هماتوكسيلين[19]                        1 گرم  

سيد سيتريك                        1 گرم

يدات سديم                         2/0 گرم

آب مقطر                       1000 ميلي ليتر

هماتوكسيلن را به كمك گرماي مختصر در آب حل كرده و يدات سديم و زاج سفيد را اضافه كرده و تكان دهيد تا محلول زاج سفيد عمل آيد. اسيد سيتريك و كلرال هيدرات را حل كرده و تاريخ و برچسب را ثبت كنيد. اين محلول كه به رنگ قرمز- بنفش درآمده براي استفاده فوري آماده است.

آماده سازي بعدي بدليل وجود يدات سديم لازم نيست. اين محلول براي چندين ماه پايداري باقي مي ماند.

اسيد الكل

محلول شماره 2:

اسيد هيدروكلريك ( وزن مخصوص 19/1 )          1 ميلي ليتر

ا تانول 70 درصد                           99 ميلي ليتر

جانشين آب جاري اسكوت ( نكته C)

محلول شماره 3:

 بيكربنات سديم                            5/3 گرم

 سولفات منيزيم                             20 گرم

 آب شير                                  1000 ميلي ليتر

 تيمول                                     1 كريستال

محلول شماره 4:

ائوزين W/S زرد رنگ [20]                        1 گرم

آب مقطر                                  100 ميلي ليتر

تيمول                                      1 كريستال

روش كار

1- پارافين مقطع را از بين برده و آبدهي كنيد.

2- در محلول شماره 1 براي 10 تا 30 دقيقه رنگ آميزي كنيد.

3- كاملا در اب شير جاري شستشو دهيد.

4- در محلول شماره 2 تمايز داده تا وقتي كه فقط هسته رنگي باقي بماند.

5- براي 5 تا 10 دقيقه در آب شير جاري يا محلول شماره 3 شستشو دهيد.

6- زمينه را با محلول شماره 4 براي 2-1 دقيقه رنگ كنيد.

7- در آب جاري شسته تا ائوزين اضافي از بين برود.

8- آبگيري، شفاف و توسط بالزام خنثي يا DPX مونت كنيد.

نتايج:

هسته سلول هاي آبي، گلبولهاي قرمز، قرمز- عضلات ، بافت همبند و سيتوپلاسم سلولهاي ، صورتي با درجات مختلف رنگ.

نكات : a) هماتوكسين – زاج سفيد هميشه مي تواند مورد استفاده قرار گيرد، زمان مناسب رنگ آميزي براي هر بسته جديد رنگ بوسيله رنگ آميزي يك اسلايد كنترل مشخص مي شود.

براي كارهاي عادي، روش معمول به عنوان يك رنگ regret ssive بكار مي رود، بواسطه عواملي مثل فيكس كردن و نوع بافت كه زمان رنگ آميزي را تحت تاثير قرار مي دهند.

b) وقتي هماتوكسيلين – زاج سفيد از قبل آماده شده بكار مي رود، براي كارهاي روزمره، مقررات – آزمايشگاه بايد ماههاي قبل را حساب كند.

c) بعد از رنگ آميزي با هماتوكسيلين – زاج سفيد اسيدي براي از بين بردن ذرات باقيمانده اسيد و منتشر كردن رنگ لازم، مقطع بايستي كاملا با آب شير شسته شود.

در جاهايي كه آب شير قليايي است شستشوي لازم بدون استفاده از محلول شماره 3 حاصل نخواهد شد.

d) 20 ميلي ليتر از اسيد استيك گلاسيال ممكن است جانشين اسيد سيتريك در محلول شماره يك شود.

e) اضافه كردن بيش از يك درصد اسيد استيك به محلول شماره 4 توسط بعضي از دست آندركاران توصيه مي شود.

f) استفاده از 5-4 قطره محلول فرمالدهايد ( 40 درصد) ممكن است بجاي تيمول در محلول شماره 4 انجام گيرد .

هماتوكسيلين ارليك[21]

يك رنگ عادي براي رنگ آميزي هسته است.

فرمول:

آمونياک يا زاج سفيد پتاسيم                     3 گرم

هماتوكسيلين                                      2 گرم

اتانل 95 درصد                                100 ميلي ليتر

گليسرول                                      100 ميلي ليتر

آب مقطر                                      100 ميلي ليتر

اسيد استيك گلاسيال                             10 ميلي ليتر

روش تهيه :

هماتوكسيلين را در يك فلاسك يك ليتري در الكل حل كرده و بعد آب اضافه كنيد. زاج را اضافه كرده و آنقدر تكان دهيد تا محلول آماده شود. بقيه اجزاء را تركيب كنيد.

فلاسك را توسط پشم كتان به ارامي بسته و با گذاشتن در هوا و تابش نور خورشيد براي 2 هفته يا بيشتر و تكان دادن روزانه، اكسده اش كنيد. به يك بطري ذخيره مناسب منتقل نموده، تاريخ را ثبت كرده و برچسب بزنيد و براي 3 تا  هفته نگهداري كرده و به طور مرتب تكان دهيد.

محلول براي چندين سال پايدار باقي مي ماند.

روش كار:

مثل روش قبل عمل كنيد از اين محلول بجاي محلول شماره يك استفاده شود.

نتايج:

هسته سلول هاي آبي، ساير اجزاء براساس رنگ زمينه.

نكات: a) اضافه كردن4/0 گرم يدات سديم اكسيداسيون فوري ايجاد خواهد كرد ولي پايداري محلول تحت تاثير قرار خواهد گرفت و زمان فعاليت مناسب كاهش خواهد يافت.

وقتي كه يدات بكار مي رود، بايد قبل از اضافه كردن اسيداستيك اضافه شود.

b) ذرات گليسرول تبخير را كاهش داده و ميزان رنگ كردن محلول را كم مي كند.

هماتوكسيلين- زاج هاريس[22]

يك رنگ معمولي براي هسته با ارزش استثنايي در سلول شناسي ورقه ورقه شدني[23] است .

 فرمول:

 زاج آمونيا با زاج پتاسيم        20 گرم

 هماتوكسيلين                        1 گرم

 اكسيد جيوه                      5/0 گرم

 آب مقطر                        200 ميلي ليتر

 اتانل خالص                      10 ميلي ليتر

هماتوكسيلين را در الكل و زاج را در آب به كمك گرماي مختصر حل كرده و محلول را در يك فلاسك جوش مخلوط كرده و سريعا جوش بياوريد.

اكسيد جيوه را اضافه كرده و سپس بالافاصله با فر بردن در اب سرد، آن را سرد نماييد.

با اضافه كردن اكسيد جيوه محلول بايستي رنگ ارغواني تيره به خود بگيرد. براي ذخيره به يك بطري مناسب منتقل كرده، تاريخ را ثبت و برچسب بزنيد. محلول براي سالها پايدار باقي مي ماند.

روش كار:

مثل روش هماتوكسيلين- زاج  اسيدي ماير عمل كرده و از اين محلول بجاي محلول شماره يك استفاده كنيد. (نكته b را در زير دقت كنيد.

نتايج:

هسته سلولها آبي ، ساير اجزاء سلول براساس رنگ زمينه

نكات:

   a) اضافه كردن 4 درصد اسيد استيك رنگ آميزي هسته را دقيق تر كرده و بايستي براي سلول شناسي استفاده شود.

B        ) زمان لازم براي رنگ آميزي گسترش 4 دقيقه است.

هماتوكسيلين كول[24]

يك رنگ معمولي براي هسته است.

فرمول:

سولفات آلومينيم آبكي اشباع              750 ميلي ليتر

هماتوكسيلين                                1 گرم

1درصد يددر الكل 70 درصد                 50 ميلي ليتر

آب مقطر                                250 ميلي ليتر

به كمك حرارت مختصر هماتوكسيلين را در يك فلاسك 2 ليتري حل كرده، محلول يد و محلول قليايي سولفات آلومينيم را اضافه نموده و خوب هم بزنيد. سريعا بجوش اورده و سپس سرد كنيد. به يك بطري تيره مناسب براي نگهداري منتقل كرده، تاريخ را ثبت، برچسب زده و در جاي سرد قرار دهيد. محلول براي چندين ماه پايدار باقي خواهد ماند.

روش كار:

مثل آنچه براي هماتوكسيلين – زاج اسيدي ماير گفته شد عمل كرده و از محلول فوق بجاي محلول شماره يك استفاده كنيد.

نتايج:

هسته سلولها آبي، ساير اجزاء براساس رنگ زمينه.

 

سليستين بلو[25]

رنگي است كه وقتي همراه با هماتوكسيلين – زاج اسيدي ماير بكار برود، به رنگهاي اسيدي قوي مقاوم بوده و هسته را بخوبي مشخص مي كند.

محلول شماره يك:

زاج آهن                        25 گرم

سيلستين بلو R                  25/1 گرم

گليسرول                       35 ميلي ليتر

آب مقطر                      250 ميلي ليتر

زاج را در آب مقطر حل كنيد. بطور معمول اگر فلاسك را يك شب در حرارت اتاق قرار دهيد محلول آماده خواهد شد. سلستين بلو را اضافه كرده و براي 3 دقيقه بجوشانيد.

سرد و فيلتر كرده و گليسرول را اضافه كنيد.

تاريخ را ثبت و برچسب بزنيد. محلول براي 12-6 ماه پايدار باقي مي ماند.

محلول شماره 2:

هماتوكسيلين – زاج اسيدي ماير يا هماتوكسيلين كول.

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين نموده و آب دهي كنيد.

2- براي 10 تا 20 دقيقه در محلول شماره 1 رنگ آميزي كنيد.

3- در آب شير غوطه دهيد.

4- براي 5 تا 10 دقيقه در محلول شماره 2 رنگ آميزي كنيد.

5- در آب غوطه دهيد.

6- در آب شير جاري شستشو دهيد.

7- رنگ زمينه را براساس نياز بكار ببريد.

8- آبگيري، شفاف و مونت كنيد.

نتايج :

هسته سلولها آبي، ساير اجزاء سلول براساس زنگ زمينه

توجه :

سلستين ابي همراه هماتوكسيلين – زاج اسيدي ماير بجاي محلولهاي قديمي هماتوكسيلين آهن بكار مي رود.

نتيجه اين تركيب به رنگهاي اسيدي مقاوم است.

هماتوكسيلين – آهن ويگرت و وان گيسون

در سطح وسيعي براي تفريق الياف عضلاني وبافت همبند استفاده مي شود.

هماتوكسيلين : محلول A:

هماتوكسيلين                    1 گرم

اتانول 95 درصد             100 ميلي ليتر

کلريد آهن: محلولB:

كلريد آهن (فريك) 29 درصد محلول آبكي       4 ميلي ليتر

اسيدهيدروكلريك [26]               1 ميلي ليتر

آب مقطر                       95 ميلي ليتر

محلول كار:

 محلول 1: محلول هماتوكسيلين                 يك حجم

         محلول كلريد آهن                 يك حجم

محلولها را مخلوط كرده و خوب هم بزنيد. مخلوط كه برنگ ارغواني تيره است، محلول خوبي براي استفاده لازم است و براي 2-1 روز فعال باقي مي ماند.

محلول 2: اسيد – الكل يك درصد

        رنگ وان گيسون

محلول 3:

اسيد پيكريك محلول مايي اشباع ( تقريبا 1 درصد) 100 ميلي ليتر

فوشين اسيدي يك درصد محلول مايي               10 -5 ميلي ليتر

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين و آبدهي كنيد.

2- براي 20 دقيقه در محلول شماره يك رنگ آميزي كنيد.

3- در آب ير شستشو دهيد.

4- در محلول شماره 2 متمايز نمائيد، ميزان تمايز را با ميكروسكوپ كنترل كنيد تا وقتي كه فقط هسته خوب رنگ بگيرد.

5- در آب شير شستشو دهيد.

6- زمينه را در محلول 3 براي 5- 3 دقيقه رنگ كنيد.

7- به آرامي خشك كنيد، در آب نشوييد.

8- سريعا با الكل 90 درصد و الكل مطلق آبگيري نموده، شفاف و توسط بالزام اسيدي يا DPX مونت كنيد.

نتايج:

هسته سلول سياه، كولاژن قرمز ، الياف عضلاني ، سيتوپلاسم سلول و گلبول هاي قرمز ، زرد

نكته: اضافه كردن چند قطره از اسيد پيكريك الكلي ااشباع به الكل آبگيري توصيه مي شود.

هماتوكسيلين – آهن هايدن هاين

يك رنگ سلول شناسي دقيقي است كه ممكن است براي نشان دادن اينكلوژن هاي هسته و سيتوپلاسم بكار رود. تخطط عضلات اداري نيز بخوبي رنگ مي گيرد.

محلول شماره 1: زاج آهن                5/2 گرم

             آب مقطر                100 ميلي ليتر

محلول شماره 2: هماتوكسيلين                5/0 گرم

            اتانل 95 درصد            10 ميلي ليتر

            آب مقطر                  90 ميلي ليتر

هماتوكسيلين را در الكل حل كرده و آب را اضافه كنيد. درب بطري را با الياف كتان بسته و براي 4 تا 5 هفته صبر كنيد تا محلول عمل آيد. تاريخ را ثبت و برچسب بزنيد. محلول براي مدت نا محدودي پايدار باقي مي ماند.

روش كار:

1. مقطع را عاري از پارافين و آبدهي كنيد.
2. براي 3 ساعت يا بيشتر در محلول شماره 1 قرار دهيد. (بعنوان موردنت)
3. در آب مقطر غوطه دهيد.
4. در مدتي مساوي آنچه در محلول شماره1 قرار  داشته در محلول شماره3 رنگ آميزي كنيد.
5. در آب مقطر غوطه دهيد.
6. در محلول1 متمايز كنيد، ميزان تمايز را با ميكروسكوپ كنترل كنيد.
7. براي مدت 5-10 دقيقه در آب شير جاري كاملاً شستشو دهيد تا تمام ذرات زاج آهن از بين برود.
8. زمينه را بر اساس نياز رنگ كنيد.
9. آبگيري، شفاف و مونت كنيد.

نتايج:

هسته سلولها، اينكلوژنهاي سيتوپلاسم و خطوط عضلات سياه، ساير اجزاء بر اساس رنگ زمينه.

نكات:

a)      اضافه كردن 1/0 گرم يدات سديم محلول هماتوكسيلين را سريعاً براي استفاده فوري عمل مي آورد.

b)      محلول2 ممكن است با آب مقطر 1 به 1 رقيق شود تا كنترل زمان تمايز طولاني تر شود.

c)      با گرم كردن محلولهاي 1 و 2 تا 45 درجه زمان رنگ آميزي تا 45 دقيقه ممكن است كاهش يابد.

رنگ آميزي الياف الاستيك به روش ورهوف[27]

براي نشان دادن الياف الاستيك بكار مي رود.

هماتوكسيلين الكلي: هماتوكسيلين                5 گرم

                اتانل خالص             100  ميلي ليتر

محلول كلريد فريك: كلريد فريك             10 گرم

                 آب مقطر               100 ميلي ليتر

محلول يدي لوگول (مثل قبلي)

محلول شماره 1:      هماتوكسيلين الكلي           20 ميلي ليتر

                 محلول كلريد فريك             8 ميلي ليتر

                 محلول يدي لوگول              8 ميلي ليتر

كلريد فريك و لوگول يدي را به هماتوكسيلين الكلي اضافه كنيد.

محلول شماره 2:     محلول كلريد فريك             20 ميلي ليتر

                آب مقطر                      80 ميلي ليتر

محلول شماره 3:    رنگ وان گيسون

روش كار:

1. مقطع را عاري از پارافين و آبدهي كنيد.
2. براي 60 – 15 دقيقه در محلول شماره يك رنگ آميزي كنيد.
3. در آب غوطه دهيد.
4. در محلول شماره 2 متمايز كنيد،درجه تمايز با ميكروسكوپ كنترل شود.
5. به الكل 95درصد منتقل كنيد.
6. در آب شستشو دهيد.
7. با محلول شماره 3 زمينه را رنگ كنيد.
8. آبگيري، شفاف و مونت كنيد.

نتايج:

الياف الاستيك سياه، هسته آبي تا سياه، كولاژن قرمز، الياف عضلاني زرد، گلبولهاي قرمز، زرد.

نكات:

a)      محلول شماره 1 فقط براي 24 تا 48 ساعت فعال باقي خواهد ماند.

b)      براي كاهش رنگ آميزي هسته ميزان محلول يدي لوگول دو برابر شود.

c)   مقطعي كه بيش از حد متمايز شده ممكن است دوباره به محلول يد برگردد و دوباره رنگ شود، از تماس آنها با الكل 95درصد بايستي اجتناب شود.

رزورسين فوشين[28]

براي نشان دادن الياف الاستيك بكار برود.

محلول 1 : فوشين بازي                         2 گرم

         زور سينول                         4 گرم

        محلول آبكي كلريد فريك 29 درصد       25 ميلي ليتر

        آب مقطر                           200 ميلي ليتر

        اتانل 95 درصد                      تقريباً 205 ميلي ليتر

        اسيد هيدروكلريك                     1 ميلي ليتر

آب مقطر را اندازه گيري و در يك ظرف لعابدار ريخته و فوشين بازي و رزورسينول را حل كنيد، به جوش آورده و محلول كلريد فريك را اضافه نموده و براي 3 تا 5 دقيقه در حال جوش نگهداشته و دائماً هم بزنيد تا وقتي كه يك رسوب تشكيل شود، سپس سرد و فيلتر كنيد و محلول فيلتر شده را دور ريخته و اجازه دهيد تا كاغذ صافي و ظرف لعابدار خشك شوند، كاغذ صافي را در ظرف لعابدار قرار داده و رسوب را در 200 ميلي ليتر الكل بوسيله گرم كردن دقيق با هم زدن مداوم حل كنيد.

كاغذ صافي را خارج و محلول را سرد و فيلتر نموده و حجم را به 200 ميلي ليتر با الكل رسانده و اسيد هيدروكلريك را اضافه كنيد. تاريخ را ثبت و برچسب بزنيد.

محلول براي 3 تا 4 ماه ثابت باقي مي ماند.

محلول شماره 2 : اسيد الكل يك درصد.

روش كار:

1. مقطع را عاري از پارافين نموده و در الكل 95 درصد قرار دهيد.
2. براي 20 دقيقه يا بيشتر در محلول شماره يك رنگ آميزي كنيد.
3. با الكل 95 درصد شستشو دهيد.
4. در محلول شماره 2 متمايز كنيد.
5. كاملاً در آب شستشو دهيد.
6. زمينه را به دلخواه رنگ آميزي كنيد.
7. آبگيري، شفاف و مونت كنيد.

نتايج:

الياف لاستيكي آبي تيره تا سياه، ساير بافتها بر اساس رنگ زمينه.

اسكارت مارتيوس آبي[29]

براي نشان دادن فيبرين بكار مي رود.

محلول 1: سلستين آبي

محلول 2: همالوم ماير

محلول3: اسيد هيدروكلريك 25/0 درصد در اتانل 70 درصد

محلول4: مارتيوس زردنيم درصددر الكل95درصدحاوي2درصد اسيد فسفوتنگستيك

محلول5: كريستال سرخ براق[30] يك درصد در استيك مايي 5/2 درصد

محلول6: اسيد فسفوتنگستيك يك درصد.

محلول7: آبي حلال[31] 5/0 درصد در اسيد استيك مايي يك درصد.

روش كار

1.       مقطع را عاري از پارافين و آب دهي نمائيد.

2.       براي 5 دقيقه در محلول شماره 1 رنگ كنيد.

3.       در آب شير آبكشي كنيد.

4.       براي 5 دقيقه در محلول شماره 2 رنگ آميزي كنيد.

5.       در آب شير آبكشي نمائيد.

6.       در محلول شماره 3 متمايز كنيد.

7.       كاملاً در آب شير بشوئيد.

8.       در الكل 95 درصد آبكشي كنيد.

9.       در محلول شماره 4 براي 2 دقيقه رنگ آميزي كنيد.

10. آبكشي در آب

11. براي 10 دقيقه در محلول شماره 5 رنگ آميزي كنيد.

12. در آب آبكشي كنيد.

13. براي 5 دقيقه به محلول شماره 6 منتقل كنيد.

14. در آب آبكشي كنيد.

15. براي 10 دقيقه در محلول شماره 7 رنگ آميزي كنيد.

16. آبگيري، شفاف و مونت كنيد.

نتايج:

هسته سلولهاي آبي، فيبرين قرمز، كولاژن آبي، گلبولهاي قرمز زرد.

توجه: روش كار ممكن است كوتاه شده و تمايز حذف شود بوسيله رنگ آميزي در محلول زير براي مدت 8 دقيقه بجاي مراحل 9 تا 15.

محلول4سه حجم،محلول5دو حجم،محلول7سه حجم،آبكشي درآب قبل از آبگيري

 رنگ آميزي رتيكولين گوردون و سويت

يك روش معمول است كه الياف رتيكولين را نشان داده ولي سلولها را رنگ  نمي كند.

 

 

محلول نيترات نقره را در يك ظرف 100 ميلي عاري از مواد شيميايي استوانه اي ريخته و آب آمونيا اضافه كنيد بصورت قطره قطره همراه با تكان دادن مداوم تا زماني كه رسوب ايجاد شده دوباره حل شود محلول هيدروكسيد سديم را اضافه نموده و دوباره رسوب را با اضافه كردن قطره قطره آب آمونيا حل كنيد، فقط رسوب بايستي حل شود و محلول نهايي بايستي كمي كدر باشد.

با آب مقطر شيشه اي حجم را به 50 ميلي ليتر برسانيد. محلول بايد در زمان مصرف آماده شود.

محلول5: فرمالين 10 درصد محلول مايي

محلول6: كلريد طلا 2/0 درصد محلول مايي

محلول7: تيوسولفات سديم 5/0 درصد محلول مايي

محلول8: سافرانين 5 درصد محلول مايي

روش كار:

1. مقطع را در آب قرار دهيد.
2. در محلول شماره 1 براي 1-5 دقيقه اكسيده كنيد.
3. در آب بشوئيد.
4. در محلول شماره 2 براي 2-5 دقيقه شستشو دهيد.
5. كاملاً در آب شير و چند دفعه در آب مقطر شستشو دهيد.
6. از محلول شماره 3 بعنوان موردنت بين 10 دقيقه تا 2 ساعت استفاده كنيد. (10دقيقه معمولاً كافي است.)
7. در چند مرحله آب مقطر شستشو دهيد.
8. در محلول شماره 4 براي 30 ثانيه قرار دهيد.
9. در چند مرحله آب مقطر شستشو دهيد.

10. در محلول 5 براي يك دقيقه احياء كنيد.

11. در آب جاري و بعد در آب مقطر شستشو دهيد.

12. براي 10 تا 15 دقيقه در محلول شماره 6 به رنگ مطلوب در آوريد.

13. در آب مقطر آبكشي كنيد.

14. در محلول شماره 7 براي 5 دقيقه فيكس كنيد.

15. براي يك تا 2 دقيقه در آب شستشو دهيد.

16. هسته ها را با محلول شماره 8 رنگ آميزي كنيد.

17. آبگيري، شفاف و مونت كنيد.

نكته: نگهداري محلول آمونياكي نقره بعلت توليد گاز خطرناك بوده و منجر به انفجار مي شود.

موسيكارمين سوت كات[32]

براي نشان دادن موسين پوشيده توسط سلولهاي اپي تليال

محلول 1: هماتوكسيلين – زاج اسيدي ماير

محلول2: كارمين                            1 گرم

      هيدروكسيد آلومينيم                1 گرم

      كلريد آلومينيم بدون آب          5/0 گرم

      اتانل 50 درصد                  100 ميلي ليتر

كارمين و هيدروكسيد آلومينيوم را در يك فلاسك 500 ميلي ليتري وزن كرده و سپس الكل را اضافه كنيد. خوب تكان داده و در حين تكان دادن كلريد آلومينيم را اضافه كنيد. دقيقاً براي 5/2 دقيقه در يك حمام آب گرم در حال جوش قرار داده، سرد، فيلتر، ثبت تاريخ و برچسب بزنيد.

 

روش كار:

1.       مقطع را عاري از پارافين و آب دهي نمايئد.

2.       در محلول يك رنگ آميزي كنيد.

3.       براي 30 تا 45 دقيقه در محلول شماره2 كه به نسبت 1 به 5 با آب مقطر رقيق شده رنگ آميزي كنيد.

4.       در آب مقطر آبكشي نمائيد.

5.       آبگيري، شفاف و مونت كنيد.

نتايج: هسته سلولهاي آبي، موسين قرمز

توجه: اگر كه محلول 2 را به نسبت 1 به 10 با آب مقطر رقيق كرده و زمان رنگ آميزي را طولاني كنيد ممكن است رنگ آميزي دقيق تري بدست آيد.

 

روش اسيد شيف پريوديك[33]

واكنش اسيد شيف پريوديك در هيستو پاتولوژي در سطح وسيعي استفاده مي شود. واكنش مربوط به گروه هاي گليكول 1 و 2 است كه در بافت وجود داشته يا شامل كربوهيدرات است، كه در اثر اكسيده شدن با اسيد پريوديت اكسيده شده و تبديل به آلدهايد مي شود.

آلدهايد وقتي با معرف شيف تماس مي گيرد، رنگ مي شود. اين عمل براي نشان دادن گليكوژن، قارچ و موسين ارزشمند است.

محلول1: اسيد پريوديك                        1 گرم

       آب مقطر                           100 ميلي ليتر

محلول2: معرف شيف   

       فوشين بازي                           2 گرم

      آب مقطر                            200 ميلي ليتر

      هيدروليك اسيد (3/98 ميلي ليتر)       20 ميلي ليتر

      بي سولفات سديم (بدون آب)              1 گرم

      ذغال فعال شده                      5/0 گرم

آب مقطر را در يك فلاسك 500 ميلي ليتري ريخته و جوش آورده و فوشين بازي را حل كنيد، تا 50 درجه سرد و فيلتر نموده و اسيد هيدروكلريك را اضافه كنيد. تا 25 درجه سرد و بي سولفيت سديم را اضافه كنيد. براي 24 تا 48 ساعت در تاريكي نگهداري كرده و در طول اين مدت محلول كاهي رنگ مي شود. با ذغال هم زده، بلافاصله فيلتر كرده و بيك شيشه قهوه اي منتقل كرده و برچسب بزنيد، و در يخچال نگهداريد.

محلول 3: اسيد سولفورو

        متابي سولفيت سديم 10 درصد          6 ميلي ليتر

        اسيداِن – هيدروكلريك              5 ميلي ليتر

        آب مقطر                   100 ميلي ليتر

محلول 4: هماتوكسيلين هاريس

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين و آبدهي نمائيد.

2- براي 5 دقيقه در محلول شماره 1 قرار دهيد.

3- در آب شير آبكشي نمائيد.

4- در آب مقطر آبكشي نمائيد.

5- براي 5 دقيقه در محلول شماره 2 قرار دهيد.

6- در سه ظرف حاوي محلول شماره 3 در هر كدام 2 دقيقه قرار دهيد.

7- در آب شير آبكشي كنيد.

8- براي 30 ثانيه در محلول شماره 4 رنگ آميزي كنيد.

9- در آب شير بشوئيد.

10- آبگيري ، شفاف و مونت كنيد.

توجه :  مرحله 6 مي تواند حذف شده و مقطع براي 10 دقيقه در اب شير جاري شسته شود.

نتايج:  هسته آبي، موسين و گليكوژن ارغواني، غشاء پايه كليه و پوست قرمز – ارغواني

تست كنترل:  يك اسلايد كنترل شامل مواد مثبت بايستي هميشه براي آزمايش كيفيت محلولها رنگ آميزي شود.

واكنش فوال ژن[34]

براي نشان دادن نوكلئو پروتئين ها.

محلول 1: اسيد هيدروكلريك يك نرمال محلول

محلول 2: معرف شيف

محلول 3: سولفيت رينز

       متا بي سولفيت پتاسيم ، 10 درصد محلول مايي  5 ميلي ليتر

       محلول يك نرمال اسيد هيدروكلريك             5 ميلي ليتر

       آب مقطر                                  90 ميلي ليتر

محلول متا بي سولفيت پتاسيم و اسيد هيدروكلريك را به آب مقطر اضافه كنيد. بلافاصله قبل از مصرف آماده نمائيد.

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين و آبدهي نمائيد.

2- سريعا در محلول شماره 1 سرد، آبكشي نمائيد.

3- به محلول شماره 1 كه قبلا تا 60 درجه گرم شده منتقل كنيد، زمان لازم براي هيدروليز براساس فيكس كننده استفاده شده فرق مي كند، ولي معمولا 5 تا 25 دقيقه است.

4- سريعا در محلول شماره 1 سرد آبكشي نمائيد.

5- در آب مقطر آبكشي نمائيد.

6- براي 30 تا 60 دقيقه به محلول شماره 2 منتقل كنيد.

7- خشك نموده و در 3 ظرف محلول شماره 3 به ترتيب 1 و 2 و 2 دقيقه در هر كدام قرار دهيد.

8- در  آب مقطر خوب آبكشي كنيد.

9- زمينه را به دلخواه رنگ آميزي كنيد ة لايت گرين 25/0 درصد در الكل 70 درصد به مدت 30 ثانيه)

10- آبگيري ، شفاف و مونت كنيد.

اسيد دي اكسي ريبونوكلئيك قرمز- ارغواني، ساير بافتها براساس رنگ زمينه ( سبز)

توجه:  مقتضي است كه چندين اسلايد را با زمانهاي مختلف هيدرولز رنگ آميزي كنيد.

آلدهايد فوشين گوموري

براي نشان دادن سلولهاي جزاير لانگرهانس و الياف الاستيك.

محلول 1: لوگول آيودين

محلول 2: تيوسولفات سديم 5/ درصد محلول مايي

محلول 3: آلدهايد فوشين

         فوشين بازي                             1 گرم

        اتانل 70 درصد                        200 ميلي ليتر

       اسيد هيدروكلريك                         2 ميلي ليتر

محلول 4: سبز روشن[35] 2/0 درصد

فوشين بازي را در الكل حل كرده و سپس اسي هيدروكلريك و پاراآلدهايد را اضافه كنيد، مخلوط را خوب هم زده و در حرارت اتاق قرار مي دهيم تا برنگ ارغواني تيره درايد ( 24 تا 48 ساعت) تاريخ را ثبت كرده و برچسب مي زنيم.

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين و آبدهي نمائيد.

2- براي 10 تا 60 دقيقه در محلول شماره 1 به عنوان موردنت قرار دهيد.

3- در آب آب كشي نمائيد.

4- براي 5 دقيقه در محلول شماره 2 قرار دهيد.

5- براي 3 دقيقه در اب شيرجاري شستشو دهيد.

6- در الكل 90 درصد ابكشي كنيد.

7- براي 10-5 دقيقه در محلول 3 رنگ آميزي كنيد.

8- در الكل 90 درصد آبكشي كنيد.

9- زمينه را به دلخواه رنگ كنيد( وان گيسون به مدت 3 دقيقه )

10- آبگيري ، شفاف و مونت كنيد.

نتايج:

الياف الاستيك ارغواني، كلاژن قرمز، ماهيچه صاف زرد، گلبولهاي قرمز زرد.

روش PAS – تري كروم ( پيرز)

يك روش رنگ آميزي مناسب براي نشان دادن سلولهاي آلفا و بتا در لب قدامي هيپوفيز پس از فيكس كردن در فرمول سيلان يا مايع هلي است.

محلول 1: اسيد پريوديك مايي 1 درصد

محلول 2: معرف شيف

محلول 3: متابي سولفيت سديم 5/0 درصد

محلول 4: سلتين آبي

محلول 5: همالوم ماير

محلول 6: اسيد هيدروكلريك يك درصد در الكل 70 درصد

محلول 7: اورنج جي 2 درصد در اسيد فسفوتنگستيك 5 درصد.

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين و آبدهي نمائيد.

2- در محلول شماره 1 كسيده كنيد.

3- در آب مقطر بشوئيد.

4- براي 20 دقيقه به معرف شيف منتقل كنيد.

5- سريعا در سه ظرف محلول 3 ابكشي كنيد.

6- براي 10 دقيقه در آب شستشو دهيد.

7- براي 1 تا 3 دقيقه در محلول شماره 4 رنگ آميزي كنيد.

8- براي 1 تا 3 دقيقه در محلول شماره 5 رنگ آميزي كنيد.

9- سريعا در محلول شماره 6 متمايز كنيد.

10- 5 دقيقه در اب شير جاري شستشو دهيد.

11- براي 10 تا 20 ثانيه در محلول شماره 7 رنگ آميزي كنيد.

12- در آب متمايز كرده تا زماني كه فقط رنگ زرد ديده شود، معمولا يك دقيقه

13- آبگيري، شفاف و با DPX مونت كنيد.

نتايج:

هسته سلول آبي – سياه ، گرانيولهاي سلولهاي بتا قرمز ، گرانيولهاي سلولهاي آلفا و ساير اجزاء اسيد وفيليك درجات مختلفي از رنگ زرد.

 

روش آلسين آبي- PAS

براي نشان دادن گروههاي اسيدي و گليكولهاي 1 و 2 كربوهيدراتها

محلول 1: آلسين ابي، 1 درصد در اسيد استيك 3 درصد

محلول 2: اسيد پريوديك 1 درصد محلول مايي

محلول 3: معرف شيف

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين و آبدهي نمائيد.

2- 5 دقيقه در محلول شماره 1 رنگ آميزي كنيد.

3- 2 دقيقه در آب شير جاري شستشو دهيد.

4- در آب مقطر آبكشي كنيد.

5- براي 2 دقيقه در محلول شماره 2 اكسيده كنيد.

6- 5 دقيقه در اب جاري شستشو دهيد.

7- در آب مقطر آبكشي كنيد.

8- براي 8 دقيقه در محلول شماره 3 قرار دهيد.

9-براي 10 دقيقه در اب جاري شستشو دهيد.

10- آبگيري ، شفاف و مونت كنيد.

نتايج:

موسين هاي اسيدي آبي، موسين هاي خنثي قرمز ارغواني، مخلوط موسينهاي اسيدي و خنثي، ارغواني.

نكته: هسته سلولها ممكن است در صورت لزوم توسط هماتوكسيلين كول بعد از مرحله 9 رنگ آميزي شود.

آلسين آبي- قرمز سريع كلرانتين

براي نشان دادن موسين و بافت همبند بكار مي رود..

محلول1: هماتوكسيلين ارليك

محلول 2: آلسين آبي 8 جي                     5/0 گرم

        آب مقطر                           100 ميلي ليتر

        اسيد استيك گلاسيال                 5/0 ميلي ليتر

        تيمول                           20-10 ميلي گرم

آلسين ابي را در 50 ميلي ليتر اب مقطر حل كرده و اسيد استيك را به بقيه آب مقطر اضافه كرده، دو محلول را مخلوط نموده، فيلتر كرده و تيمول را اضافه كنيد. تاريخ را ثبت و برچسب بزنيد.

محلول 3: اسيد فسفوموليبديك يك درصد محلول مايي

محلول 4: قرمز سريع كلرانتين – 5- بي                 5/0 گرم

آب مقطر                        100 ميلي ليتر

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين و آبدهي نمائيد.

2- براي 15-10 دقيقه در محلول شماره 1 رنگآميزي كنيد.

3- در آب شير بشوئيد.

4- براي 10 دقيقه در محلول شماره 2 رنگ آميزي كنيد.

5- در آب مقطر آبكشي كنيد.

6- براي 10 دقيقه در محلول شماره 3 به عنوان موردنت قرار دهيد.

7- در آب مقطر آبكشي كنيد.

8- براي 10 تا 15 دقيقه در محلول شماره 4 رنگ آميزي كنيد.

9- در آب مقطر آبكشي كنيد.

10- آبگيري ، شفاف و مونت كنيد.

نتايج:

هسته سلول ارغواني – آبي ، موسين ، مواد زمينه غضروف ، بعضي از الياف بافت همبند و گرانيولهاي سلولهاي ماست، آبي- سبز، سيتوپلاسم سلول و الياف عضلاني زرد كمرنگ، الياف كولاژن قرمز

روش پرل براي آهن فريك

براي نشان دادن نمكهاي فريك در بافت استفاده مي شود.

محلول 1: فروسيانيد پتاسيم 2 درصد محلول مايي            1 حجم

        اسيد هيدروكلريك 2 درصد                       1 حجم

محلول 2: قرمز خنثي يك درصد محلول مايي

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين و آبدهي نمائيد.

2- براي 30 تا 60 دقيقه به محلول شماره 1 كه تازه آماده شده منتقل كنيد.

3- در آب مقطر بشوئيد.

4- براي 3 دقيقه در محلول شماره 2 رنگ آميزي كنيد.

5- در آب مقطر بشوئيد.

6- آبگيري ، شفاف و مونت كنيد.

نتايج: هسته سلولها قرمز، آهن فريك آبي.

روش ون كوسا براي نشان دادن كلسيم[36]

محلول 1: نيترات نقره                            5 گرم

آب مقطر شيشه اي                            100 ميلي ليتر

نيترات نقره را در آب مقطر حل كرده و در شيشه قهوه اي ريخته و برزچسب بزنيد.

محلول2: تيوسولفات سديم محلول مايي                5 درصد

محلول 3: كارمالوم كيرك پاتريك[37]

توجه : a) محلول 1 بايستي بي رنگ باشد، اگر ابي رنگ شد بايستي دور ريخته شود، آب مقطر بايد عاري از آهن باشد.

b) از فيكس كننده هاي داراي اسيد يا دي كرومات پتاسيم بايد اجتناب شود.

روش كار:

1- مقطع را عاري از پارافين و آبدهي نمائيد.

2- براي 5 دقيقه يا بيشتر در محلول شماره 1 در معرض نور روز قرار دهيد.

3- در آب مقطر شستشو دهيد.

4- براي 5 دقيقه در محلول شماره 2 فيكس كنيد.

5- در آب مقطر شستشو دهيد.

6- براي 5-3 دقيقه با محلول شماره 3 رنگ آميزي كنيد.

7- آبگيري ، شفاف و مونت كنيد.

نتايج:

فسفات و كربنات كلسيم سياه، هسته سلولها قرمز.

روغن قرمز، او، در ايزوپروپانول ( ليلي و آشبورن)

براي نشان دادن چربيهاي خنثي

محلول ذخيره :

         روغن قرمز او                 5/0 گرم

         ايزوپروپيل99 درصد            100 ميلي ليتر

محلول 1:

        محلول ذخيره                           6 حجم

        آب مقطر                             4 حجم

محلول ذخيره را با اب مقطر رقيق كرده براي 10 دقيقه ساكن بگذاريد و بعد با كاغذ صافي واتمن نمره 2 فيلتر كليد، محلول فيلتر شده براي چندين ساعت پايدار باقي مي ماند.

محلول 2: هماتوكسيلين – زاج اسيدي ماير

روش كار:

1- مقطع انجمادي فيكس شده در فرمالين رادر محلول شماره 1 براي 10 دقيقه رنگ كنيد.

2- در آب مقطر شستشو دهيد.

3- به ارامي در محلول شماره 2 براي 2-1 دقيقه رنگ آميزي كنيد.

4- در اب شير شستشو دهيد.

5- مقطع را روي اسلايد قرار دهيد.

6- با ژل گليسرين مونت كنيد.

نتايج:

چربي قرمز ، هسته سلولها ابي

توجه :

سودان سياه B ممكن است به جاي روغن قرمز او جانشين شود.

 

 

 

---

دسته بندی : تهیه مقطع

فصل 10

روشهاي رنگ آميزي[1]

وسايل رنگ آميزي:

سه روش براي رنگ آميزي لامها وجود دارد:

1- استفاده از ظروف رنگ آميزي[2]

2- استفاده از راك رنگ آميزي[3]

3- استفاده از ماشين رنگ آميزي[4]

 

ظروف رنگ آميزي

تعداد زيادي از اين ظروف در دسترسند، جارهاي كوچك براي رنگ آميزي تكي اسلايد مورد استفاده قرار مي گيرد Coplin jare  به اندازه 5 تا 10 اسلايد حجم داشته و ظروف رنگ آميزي بزرگ با سبدهاي جداگانه كه قادرند بطور همزمان 20اسلايد را رنگ آميزي نمايند.

راكهاي رنگ آميزي

دو ميله شيشه اي بصورت جفتي روي سينك ثابت شده و اسلايدها در سرتاسر اين ميله ها قرار گرفته و محلولها با استفاده از شيشه قطره چكاني روي آنها مي ريزند.

ساير وسايل براي رنگ آميزي عبارتند از:

1- يك چراغ براي گرم كردن رنگها

2- هات پليت براي سفت كردن محيط مونت كردن

3- يك ميكروسكوپ و لامپ براي كنترل درجه رنگ آميزي

روش رنگ آميزي مقاطع پارافيني

قبل از اينكه مقاطع پارافيني بتوانند رنگ آميزي شوند بايستي پارافين اطراف از بين رفته و مقطع از الكل هاي درجه بندي شده به آب مقطر منتقل شود.

از تكرار بي جهت مراحل رنگ آميزي اجتناب كنيد. اصطلاح Hydrate , de - wax  براي انجام روش زير بكار مي رود:

1- مقطع را با غوطه ور كردن در زيلن بمدت 2 تا 3 دقيقه عاري از پارافين نماييد. اين عمل ممكن است با گرم كردن روي چراغ الكلي و ذوب پارافين، تسريع شود.

2- براي خارج كردن زيلن اسلايد را 30 ثانيه در الكل مطلق قرار دهيد. براي انتقال اسلايدها از يك محلول به محلول ديگر از پنس نوك پهن استفاده كنيد.

3- براي اطمينان از خروج كامل زيلن 30 ثانيه در ظرف الكل ديگر قرار دهيد، به الكل با درجه پايين منتقل نكنيد.

4- براي 30 ثانيه به الكل 90 درصد منتقل كنيد.

5- براي 30 ثانيه به الكل 70 درصد منتقل كنيد.

6- اسلايد را بطور كامل در آب مقطر بشوييد.

حالا مقطع براي رنگ آميزي با روشهاي از پيش تعيين شده آماده است.

بعد از رنگ آميزي بايستي وقطع دوباره از الكل هاي درجه بندي شده 70 و 90 درصد و از 2 ظرف الكل مطلق عبور داده شده و بطور كامل در الكل مطلق شسته شود.

بعداً بايستي مقطع در دو ظرف حاوي زيلن شفاف شود. هدف از اين مرحله دو چيز است: اولاً پس از اينكه مقطع در زيلن غوطه ور شد، با مخلوط زيلن DPX يا با الزام قابل امتزاج است. ثانياً ضريب انكار نور مقطع افزايش يافته و تقريباً به همان اندازه اسلايد شيشه اي مي شود، اين فاكتور از اين نظر مهم است كه وقتي مقطع زير ميكروسكوپ آزمايش مي شود انكسار نور حداقل كاهش را نشان مي دهد.

رنگ آميزي مقاطع انجمادي

مقاطع انجمادي ممكن است قبل از رنگ آميزي به اسلايد بچسبد يا بطور جداگانه رنگ آميزي شوند.

بعضي مقاطع كه چربي در آنها نشان داده مي شود. معمولاً بوسيله عبور از مقدار كم محلول رنگي رنگ شده و بعد در يك ظرف حاوي آب قرار گرفته و به اسلايد منتقل شده و توسط يك محيط مايي چسبانده مي شود.

اسلايدهاي كنترل و آزمايش

از اسلايدهايي كه بعنوان مثبت شناخته مي شوند بايستي بعنوان كنترل روشهاي رنگ آميزي اختصاصي شود.

بسته هاي جديد رنگ قبل از اينكه براي رنگ آميزي معمولي مورد استفاده قرار گيرند بايد با اسلايدهاي كنترل آزمايش شوند.

رنگدانه ها[5]

وقتي كه مقاطع رنگ آميزي شده بصورت ميكروسكوپي آزمايش مي شود، اغلب رسوب يا رنگدانه مشاهده مي شود كه ممكن است منشاء مصنوعي يا طبيعي داشته باشد.

رنگدانه هاي مصنوعي

معمولاً دو نوع رنگدانه مصنوعي وجود داشته كه با آنها برخورد مي كنيم كه هر دو وسيله اثر بعضي فيكس كننده هاي خاص تشكيل مي شوند مثل رسوب كلريد جيوه و رسوب فرماليدها پس از مرگ.

باقيمانده كلريد جيوه

ساختمان دقيق اين باقيمانده بخوبي شناخته نشده و در تمام بافتهايي كه در يك فيكس كننده حاوي كلريد جيوه نگهداري شود، ديده شده و بصورت توده هاي سياه رنگ بنظر مي رسد و با باقيمانده هاي ريز قهوه اي رنگ رسوبات فرماليدها فرق دارد. ممكن است بوسيله عمل يد (كه بعداً شرح داده خواهد شد) از مقطع خارج شود.

يك روش ديگر اضافه كردن چند قطره از محلول اشباع يد الكلي به هر يك از الكل هاي آبگيري است، ولي عيب اين روش اين است كه يد بافت را براي برش دادن

شكننده مي كند.

رسوب پس از مرگ فرمالدهايد

اين رنگدانه اغلب در بافتهايي بوجود مي آيد كه 24 ساعت يا بيشتر پس از مرگ برداشته شده باشند. عقيده بر اين است كه يكي از محصولات تخريب هموگلوبين بوده و اساساً در بافتهاي خون ساز مشاهده مي شود مثل كبد و طحال. وقتي فرمالدهايد خنثي يا بافره با PH=7  باشد اين رنگدانه بوجود نمي آيد و به همين دليل بعنوان رنگدانه فرمالين اسيدي گفته مي شود. بسادگي در محلول اسيد پيكريك الكلي اشباع يا محلولهاي قليايي محلول بوده و به آساني توسط روشهايي كه بعداً ذكر خواهد شد، از بين مي رود.

رنگدانه هاي طبيعي

به دو دسته با منشاء داخلي و منشاء خارجي تقسيم مي شوند.

رنگدانه هاي خارجي

اين رنگدانه ها شامل مواد خارجي جذب شده توسط بدن در طول زندگي هستند. معمولي ترين آنها كربن بوده، كه بصورت رنگدانه هاي Jet – black در مقاطع ريه و غدد برونكيال بوجود مي آيد. برداشتن اين رنگدانه كربن از مقطع غير ممكن است. مثال ديگر از اين نوع مركب كبود است.

رنگدانه هاي داخلي

اينها توسط خود ارگانيسم توليد مي شوند و شامل انواع مختلف بوده كه در حين مطالعه مقاطع با آنها برخورد مي كنيم. هموسيدرين (آهن آزاد) يكي از آنهايي است كه خيلي مشمول بوده و در صورت لزوم بروش بافت شناسي بوسيله واكنش آبي پروسيان[6] نشان داده شده و يا در صورت لزوم چون محلول در اسيد است براحتي از بين مي رود. رنگدانه هاي حقيقي ديگري كه در اين گروه قرار مي گيرند، ملانين و كلسيم هستند.

رنگدانه هاي داخلي براحتي مي توانند توسط تستهاي شيميايي مشخص شوند.

 

 مونت كردن مقاطع

پس از رنگ آميزي، مقاطع بايستي بصورت دائمي جهت آزمايش ميكروسكوپي آماده شوند. اين كار بوسيله مونت كردن مقاطع در يك محيط مناسب زير يك لامل شيشه اي انجام مي شود.

ماده اي كه بيشتر براي اين منظور بكار مي رود كانادا  با الزام Canada bal sam است. كه ممكن است بصورت اسيدي يا خنثي باشد و يا DPX.

انتخاب محيط مونت كننده كلاً به روش رنگ آميزي استفاده شده بستگي دارد.

روش مونت كردن مقاطع

1. يك لامل در اندازه مناسب را تمييز نموده و روي ميز روي ورقه كاغذ واتمن نمره يك قرار دهيد.
2. اضافه زيلن را از روي لام بوسيله يك پارچه بدون گرد و غبار خشك كنيد.
3. لام را روي كاغذ صافي در مجاورت لامل قرار دهيد.
4. اسلايد را توسط يك كاغذ صافي شماره يك تاشده به آرامي خشك كنيد.
5. ميزان لازم از محيط مخصوص مونت كردن روي مقطع قرار دهيد.
6. با دقت اسلايد را وارونه كرده و روي لامل قرار دهيد، با يك فشار مختصر محيط مونت را پخش كرده تا به لبه لامل برسد.
7. اسلايد را برگردانده و در صورت لزوم با نيدل مخصوص مونت كردن آنرا تنظيم كنيد.
8. پس از اينكه مقطع مونت شد، بايستي اسلايد براي 12 تا 24 ساعت در انكوباتور 37 درجه قرار گيرد تا محيط مونت سفت شود. در صورتيكه اسلايد قبل از سفت شدن محيط مونت آزمايش شود. اغلب لامل حركت كرده و باعث صدمه مقطع مي شود. اگر لازم باشد كه مقطع سريعاً آزمايش شود بايد روي هات پليت قرار گيرد تا خشك شود.

 توجه: 1- منظور از خشك كردن مقطع اينست كه تمام زيلن اضافي از بين برود چون در غير اين صورت زيلن با محيط مونت مخلوط شده و باعث تشكيل حبابهاي هوادر زير لامل مي شود خشك كردن خيلي محكم مقطع باعث ايجاد چروكيدگي و ترك در بافت مي شود.

2- زيادي بالزام نيز ممكن است توسط يك پارچه آغشته به زيلن پاك شود.

 

3- اگر DPX بعنوان محيط مونت استفاده مي شود، اضافه اش بايستي از روي اسلايد پاك شود چون پس از 24 ساعت كه خشك شد اضافه اش بصورت مخطط روي اسلايد ظاهر مي شود و اين براي خنثي كردن چروكيدگي كه در موقع خشك كردن ايجاد شده ضروري است .

لامل مورد استفاده بايد در الكل مطلق روي ميز رنگ آميزي نگهداري شود،ضخامت لامل معمولا حدود 8/1- ميليمتر بوده و براي استفاده در يك اسلايد به ابعاد 1×3 اينچ لامل 22×22 تا 22×50 ميلي متر استفاده مي شود.

محيط مونت كردن

محيط لازم براي مونت كردن نمونه هاي ميكروسكوپي آماده شده ممكن است بدو گروه اصلي تقسيم شود.

1- محيط هاي مايي[7] 2- محيط رزيني[8]

محيط هاي گروه اول بدو صورت مونت يا دائم قابل تركيب با آب تهيه مي شوند مثل مقاطع انجمادي رنگ شده براي چربي. در فرمول اينها يك ماده جامد كننده مثل ژلاتين يا صمغ عربي به گليسرول اضافه شده تا از خشك شدن و ترك خوردن جلوگيري كند، همچنين قندهاي مختلف كه باعث افزايش ضريب شكست نور و نگهداري مي شوند افزوده مي گردد.

گروه دوم ممكن است بدو گروه طبيعي و مصنوعي تقسيم شوند، مهمترين رزين طبيعي كانادابالزام است و تعداد زيادي ديگر نيز به صورت تجارتي وجود دارند.

 

---

دسته بندی : تهیه مقطع

فصل 9

رنگ آمیزی

رنگ آميزي بيولوژيكي[1]              

اجزاء سلولي غالباً داراي ضريب انكسار نور متفاوت بوده كه براي تشخيص اجزاء بوسيله ميكروسكوپهاي مختلف مورد استفاده قرار مي گيرد.

معذالك براي مطالعه دقيق و تهيه نمونه هاي ثابت و پايدار، روشهاي مختلف رنگ آميزي بكار مي روند. رنگهاي بيولوژيكي از رنگهايي كه بر اساس اختصاصات و روشهاي مطمئن براي اهداف خاص در نظر گرفته مي شوند، تهيه مي شوند. اين رنگها بدو دسته تقسيم مي شوند، سنتزي كه بمراتب گروه بزرگتري را شامل مي شوند و طبيعي، معذالك بعضي رنگهاي بيولوژيكي خيلي مهم مثل هماتوكسيلين و كارمين متعلق به گروه طبيعي هستند.

همچنين رنگها مي توانند به گروههاي اسيدي، بازي يا خنثي (تركيب رنگهاي اسيدي و بازي) طبقه بندي شوند.

يكي از مشكلاتي كه بيولوژيستها با آن روبرو هستند، به واسطه كاربرد مترادفات زياد، تشخيص دقيق رنگهاي استفاده شده در روشهاي رنگ آميزي است.

مرجع استاندارد عملي مورد استفاده براي تشخيص رنگها، ضريب رنگي[2] است در اين طبقه بندي رنگها تحت نام ژنريك و بر اساس رنگ و موارد استفاده گروه بندي شدند. وقتي ساختمان شيميايي رنگها شناخته شد، يك شماره ساختماني (CI . NO) به آن اختصاص يافته و رنگهاي با ساختمان مشابه ولي نام تجارتي متفاوت همان شماره ساختماني را گرفتند.

 

 رنگهاي طبيعي[3]

هماتوكسيلين[4]

هماتوكسيلين رنگي است كه از استخراج بوسيله اتر از چوب درخت مكزيكي مشتق مي شود. اين رنگ داراي خاصيت رنگ آميزي كمي بوده و معمولاً با موادي كه خاصيت رنگها را زياد مي كنند[5] بكار مي رود.

هماتوكسيلين بايستي بوسيله در معرض هوا و نورخورشيد قرار گرفتن كه باعث اكسيد شدن هماتوكسيلين به صورت ماده رنگي ضروري هماتين مي شود، عمل آورده شود.

اين يك عمل آهسته بوده ولي با افزودن مقدار كم محلول خنثي پراكسيد هيدروژن يا ساير مواد اكسيدكننده قوي مي تواند تسريع شود.

Mordant عبارت از ماده اي است كه با بافت و رنگ مخلوط شده و آنها را به هم متصل كرد و باعث يك واكنش رنگي بين آنها مي شود.

براي اين منظور معمولاً در بافت شناسي از تركيبات آلومينيم و آهن و گاهاً كروميم و مس استفاده مي شود. تركيبات آلومينيم براي رنگ آميزي هاي پيشرونده[6] بافتها بصورت عمده مناسبند، ولي تركيبات آهن براي مقاطعي كه تعريق بايد در آنها اتفاق بيافتد فقط بكار مي رود.

لازم نيست كه مورد نت ها در محلول رنگ آميزي وارد شوند، بلكه بعضي از فيكس كننده ها اساساً براي چنين خاصيتي بكار مي روند. وقتي كه الياف ميلينه سيستم اعصاب مركزي بايد نشان داده شود، بافت معمولاً در فرمول سيلان 10درصد فيكس شده و قبل از قالب گيري در مورد نت اوليه ويگرت[7] كه مخلوطي از دي كرومات پتاسيم و فلور كرم است قرار مي گيرد.

كوشينيال و مشتقاتش[8]

كوشينيال يكي از رنگهاي قديمي بافت شناسي بوده كه از بدن ساسهاي كوشينال ماده استخراج مي شود. رنگ بدست آمده با آلوم تركيب شده و يك محصول نسبتاً عاري از مواد بيگانه توليد مي شود كه بعنوان كارمين شناخته مي شود كه در سطح وسيعي براي رنگ آميزي نمونه هاي جانورشناسي مورد استفاده قرار مي گيرد، وقتي با اسيد پيكريك مخلوط شود (پيكروكارمين) براي نر و پاتولوژي خيلي مفيد است. همچنين يك رنگ قوي هسته بوده و براي نشان دادن گليكوژن[9] به روش فوق الذكر بكار مي رود.

اورسئين[10]

اورسئين يك رنگ گياهي است كه از گل سنگهاي[11] خاصي با اثر آمونيا و هوا استخراج مي شود. داراي رنگ بنفش، يك اسيد ضعيف و محلول در قلياهاست، استفاده اصلي اش در بافت شناسي براي نشان دادن الياف الاستيك است[12].

 

ليتموس[13]

ليتموس نيز از گلسنگها بدست مي آيد ولي اينها با آهك و پتاس يا سود عمل مي آيند، بعلاوه در معرض آمونيا و هوا. ليتموس

 يك رنگ ضعيف بوده و براي رنگ آميزي بافتها استفاده نمي شود.

بلكه در سطح وسيعي بعنوان يك معرف استفاده شده و تا حد زيادي توسط رنگهاي مصنوعي جانشين شده است.

سافرون[14]

يك رنگدانه طبيعي است كه از كلاله زعفران[15] استخراج شده، در بافت شناسي زياد استفاده نمي شود ولي با Masson براي رنگ آميزي بافت همبند تركيب مي شود.

رنگهاي مصنوعي[16]

اين رنگها اغلب تحت عنوان رنگهاي قطران ذغال سنگ[17] شناخته مي شوند، چون در اصل از مواد حاصل از قطران ذغال سنگ تهيه مي شوند. تمام اين تركيبات مشتقات هيدروكربني بنزن C₆H₆ بوده كه داراي 6 اتم كربن در گوشه هاي يك شش ضلعي منظم همراه با يك اتم هيدروژن چسبيده به هر اتم كربن مي باشد.

تركيبات ساده بنزن اشعه ماوراء بنفش طيف نوري را جذب كرده و بعضي مواد (كروموفورها) قادرند اين اشعه جذب شده را به قسمت قابل ديد طيف حركت دهند، در نتيجه رنگ قابل رؤيت بوجود مي آيد. تركيبات بنزني داراي كرموفورها بعنوان كرموژن ها شناخته مي شوند.

گروه نيتريت يك كرموفور است و اگر سه تا از اين گروه ها جانشين سه اتم هيدروژن بنزن شود، تركيب تري نيتروبنزن ساخته مي شود. اين كروموژن رنگي بوده ولي يك رنگ نيست.

فرق كروموژنها با رنگها اينست كه رنگها، رنگ خود را به سادگي به بافت منتقل مي كنند، قبل از اينكه يك ماده بتواند يك رنگ ناميده شود، بايستي قادر به نگهداري توسط بافت باشد. يك كروموژن بعد از اضافه شدن يك راديكال ديگر به نام اوكزوكروم[18] تبديل به رنگ مي شود. اگر يك اتم هيدروژن ديگر بوسيله يك گروه هيدروكسيل جانشين شود، اسيدپيكريك بوجود مي آيد كه بواسطه توانايي اش در تشكيل نمك با قلياها يك رنگ شناخته مي شود.

اسيد پيكريك يك ماده بي نظير بوده چون تنها ماده اي است كه ممكن است بعنوان فيكس كننده، تفريق كننده و رنگ مورد استفاده قرار گيرد. بطور خلاصه يك زنگ مصنوعي عبارت است از يك مشتق بنزن كه يك اوكزوكروم به آن اضافه شده باشد.

رنگهاي بازي، اسيدي و خنثي

خاصيت اوكزوكروم تعيين مي كند كه آيا رنگ حاصل داراي خاصيت اسيدي يا بازي است.

 

رنگهاي بازي

در رنگهاي بازي مثل بلود و متيلن ماده رنگي در قسمت بازي تركيب قرار گرفته است. راديكال اسيدي بي رنگ معمولاً از اسيدهيدروكلريك، سولفوريك يا استيك مشتق مي شود.

رنگهاي اسيدي

بر اين رنگها مثل ائوزين، ماده رنگي در جزء اسيدي قرار گرفته و پايه اش معمولاً سديم است.

رنگهاي خنثي

اينها در اثر مخلوط كردن محلول مايي رنگهاي اسيدي و بازي حاصل مي شوند. رسوب حاصل معمولاً در آب نامحلول بوده ولي در الكل محلول است مثل رنگ ليشمن. رنگهاي خنثي هم هسته و هم سيتوپلاسم را رنگ كرده بطوريكه هسته توسط رنگهاي بازي و سيتوپلاسم توسط رنگهاي اسيدي رنگ مي گردند.

روشهاي رنگ آميزي رنگها

رنگها ممكن است بر اساس خواص رنگ آميزي سيتولوژيك يا ميكروآناتوميكالي كه دارند مورد توجه قرار گيرند.

رنگهاي ميكروآناتوميكال براي نشان دادن وضعيت عمومي بافتها نسبت به يكديگر بكار مي روند، هسته و سيتوپلاسم تفريق شده ولي به ساختمانهاي داخلي آنها اهميت داده نمي شود.

رنگهاي سيتولوژيك ساختمانهاي ريز داخل هسته و سيتوپلاسم را بدون كمك در تفريق عمومي انواع مختلف بافت نشان مي دهد.

رنگ آميزي هايي كه در آنها از يك موردنت كمك گرفته مي شود مثل هماتوكسيلين به نام رنگ آميزي غير مستقيم ناميده مي شوند، ولي وقتي كه موردنت لازم نباشد مثل اكثر رنگهاي آنيليني مايي يا الكلي، رنگ آميزي مستقيم گفته مي شودو موردنتها مواد فلزي بوده كه مثل يك پل بين رنگ و بافت عمل مي كنند و به سه طريق مورد استفاده قرار مي گيرند:

1- قبل از بكار بردن رنگ[19] مثل  Weigert`s Iron Haematoxylin 

2- همراه با رنگ (رنگ آميزي متاكروم) مثل  Ehrlich`s acid alum haematoxylin

3- بعد از بكار بردن رنگ[20]  مثل رنگ گرم

موادي كه وقتي به يك محلول رنگي اضافه شوند و قدرت رنگ آميزي محلول را افزايش دهند، بدون عمل كردن بعنوان يك موردنت، تسريع كننده[21] ناميده مي شوند.

رنگهايي كه اجزاء بافتها را در يك مدت تعيين رنگ مي كنند، رنگهاي پيشرونده[22] ناميده مي شوند. آنهايي كه تمام اجزاء بافت را در يك زمان رنگ كرده و ضرورتاً شسته تفريق مي شوند قبل از اينكه بتوانيم اجزاء جداگانه را مطالعه كنيم، رنگهاي برگشت كننده[23] ناميده مي شوند.

رنگ آميزي اينكلوژنها در سلولهاي زنده به رنگ آميزي حياتي[24] بر مي گردد. سلولهاي زنده ممكن است بعد از جدا شدن از ارگانيسم رنگ شوند[25] يا در حين اينكه هنوز قسمتي از بدن هستند[26]. رنگهاي اختصاصي فقط روي ساختمانهاي خاصي از سلول بافت عمل كرده و روي ساير قسمتهاي باقيمانده بي اثر يا كم اثر است.

معذالك اختصاصيت معمولاً مربوط به كاربرد روش معيني است. بيشتر رنگها بافت را با درجات مختلف رنگ اصلي شان رنگ مي كنند. معذالك بعضي بافتها رنگهاي مختلف را از محلولي كه در آن غوطه ور مي شوند بخود مي گيرند، كه اين بعنوان يك رنگ آميزي متاكروماتيك شناخته مي شود، پديده اي كه فقط با رنگهاي آنيليني بازي مثل متيل ويولت كه اغلب در آسيب شناسي براي نشان دادن نفوذ آميلوئيد بكار مي رود، ديده مي شود.

رنگ آميزي منفي[27] براي آزمايش ساختماني باكتريها بكار مي رود، ارگانيسم ها و مواد انتخاب شده روي يك لام مخلوط مي شوند، وقتي كه لام در زير ميكروسكوپ بررسي شود، ارگانيسم هاي رنگ شده بطور واضحي از زمينه سياه متباين مي شوند

بافتهاي خاص تشكيل دهنده و بعضي ارگانيسم ها به وسيله روشي به نام اشباع سازي[28] نشان داده مي شوند. محلولهايي كه در اين روش بكار مي روند، رنگ نبوده، بلكه محلولهايي از نمكهاي فلزي هستند و فرقشان با رنگها در اينست كه اينها بي رنگ هستند.

مواد شيميايي مات روي سطح بافت يا باكتري رسوب مي كند. يك رنگ بوسيله بافت جذب مي شود ولي يك ماده اشباع كننده در سطح بافت ته نشين مي شود و اين باعث مي شود كه بعضي از ارگانيسم ها مثل اسپيروكتها بزرگتر از اندازه واقعي شان ظاهر شوند.

 

 

دسته بندی : تهیه مقطع

فصل 8

برش مقاطع

 

آماده كردن مقاطع پارافيني

اصلاح كردن قالب :

اگر چند قطعه بافت در يك قالب  قالب گيري شده اند بايستي به چندين قطعه تقسيم شوند. كه ممكن است توسط ايجاد يك شكاف V شكل در پارافين بينابيني و سپس شكستن در طول آن خط انجام شود و اگر قطعات بافت خيلي نزديك هم باشند، بايستي توسط اره بسيار ظريف قالب تقسيم شود. قالب هاي پارفيني جدا از هم بايستي توسط يك تيغ دستي اصلاح شوند، تا فاصله  اينچ از بافت به طوري كه لبه هاي قالب موازي باشند.

پارافين اضافي روي سطح بافت نيز بايستي تراشيده شود. قالب هاي اصلاح شده بايستي به طور جداگانه همراه با برچسب مربوطه در جعبه هاي مقوايي نگه داري شوند.

چسباندن قالب به نگهدارنده

يك اسپاتول دسته چوبي را روي چراغ الكي گرم كرده و آن را روي سطح نگه دارنده قالب نگه داريد قالب پارافيني را روي اسپاتول قرار دهيد.

اسپاتولهاي داغ پارافين را روي نگه دارنده قالب و ته قالب ذوب مي كنند، بعد از چند ثانيه اسپاتول را بيرون كشيده و قالب پارافيني را محكم روي نگهدارنده فشار دهيد.

حالا اتصال بين اين دو بوسيله داغ كردن دوباره اسپاتول و چرخاندن آن در اطراف ته قالب پارافيني درزگيري مي شود.

قرار دادن قالب در جهت صحيح روي ميكروتوم

1- نگهدارنده قالب را در وضعيت مناسب روي ميكروتوم ثابت كنيد.

2- مكانيسم تغذيه كننده را عقب بكشيد.

3- يك تيغه مناسب روي ميكروتوم سوار كرده و توسط پيچهاي محكم كننده آن را محكم كنيد.

4- نگهدارنده قالب را به جلو حركت دهيد تا قالب تقريبا در تماس با لبه تيغه قرار گيرد.

5- اگر ميكروتوم فاقد پيچهاي[1] تنظيم است بايستي قالب قبل از چساباندن به نگهدارنده بدقت اصلاح شود، اگر پيچ هاي تنظيم كننده وجود داشته باشد، موقعيت نگهدارنده قالب را بايد طوري تنظيم كرد كه سطح مورد برش و لبه پايين تر قالب در موقع تماس موازي لبه تيغه باشند.

6- تمام پيچهاي سفت كننده ميكروتوم بايد چك شود.

7- تنظيم ضخامت بايد كنترل شود كه روي 15 ميكرون قرار گيرد و انتهاي تيغه براي اصلاح قالب بكار رود تا زماني كه تمام سطح برش داده شود. حالا قالب آماده برش است.

برش مقاطع

ضخامت لازم و موقعيت تيغه را طوري كه مركز تيغه براي برش در نظر گرفته شود تنظيم كنيد پيچ پشت مكانيسم تغذيه را ببنديد.

ميكروتوم را دوباره بكار اندازيد تا وقتي كه برش كاملي دوباره بريده شود و سپس ريتم منظم بريدن را حفظ كنيد. ميزان برش با توجه به طبيعت بافت، اندازه قالب و نوع ميكروتوم فرق مي كند.

سرعت برش مناسب براي قالبهاي مختلف به طور تجربي مشخص مي شود، اگر قالب تراشيده و لبه هاي بالايي و پاييني اش موازي تيغه باشند، مقاطع تشكيل نوار مي دهند. كه اين به علت گرماي مختصري است كه بين قالب و لبه تيغه توليد مي شود. برش را ادامه دهيد تا طول برش به حدود 6 اينچ برسد، سپس سر آزادش را توسط برس مخصوص يا پنس نازك نگه داشته و برس ديگر را مرطوب كرده و آخرين مقطع بريده شده را به آرامي بلند كنيد، و نوار را طوريكه سطح مقوايي آن بالا قرار گيرد، روي يك قطعه مقوا يا يك كاغذ سياه قرار دهيد.

اگر اقدامات لازم براي اصلاح قالب و قرار دادن آن روي ميكروتوم به درستي انجام شده باشد، نتيجه ناقص معمولا مربوط به يكي از علل زير است:

نفوذ ناكافي

اگر آبگيري، شفاف كردن يا نفوذ پارافين ناكافي باشد ممكن است باعث خرد شدن مقاطع شود.

اين به سادگي قابل تشخيص است، به اين ترتيب كه قالب معمولا بوي مواد شفاف كننده را مي دهد، لذا قالب بايستي تا حد ممكن اصلاح شده و برگردد به آون براي ذوب باقيمانده پارافين و سپس به ماده شفاف كننده منتقل شود. اگر حدس زده شود كه آبگيري ناقص است، بايستي به الكل خالص منتقل شود.

 

عيب لبه تيغه :

بيشتر نواقص مي تواند به آماده كردن نامناسب تيغه نسبت داده شود. شكاف روي لبه تيغه اغلب باعث بريدگي روي مقاطع به صورت خطوطي عمودي مي شود.

براي برطرف كردن اين حالت، تيز كردن دوباره و يا حركت آن در طول نگهدارنده اش بايد انجام گيرد.اگر تيغه كند باشد، مقاطع ممكن است بطور متناوب كلفت و نازك بريده شوند، اين حالت نيز با تيز كردن تيغه برطرف خواهد شد.

قرار دادن نادرست تيغه:

تيغه بايد با يك زاويه روي ميكروتوم قرار گيرد، بطوريكه يك زاويه مشخص بين سطح برش و قالب ايجاد شود. زاويه بين 6-1 درجه بيشترين رضايت را فراهم مي كند، تيغه دو طرف مقعر احتياج به زاويه كوچكتري نسبت به تيغه گوه اي دارد ( شكل زير) نقص در زاويه تيغه منجر به نواقص زير مي شود:

 Cattering

اين اصطلاح براي شرح خطوط افقي يا شيارهايي در سرتاسر مقطع، بكار مي رود، تيغه در حين برش مقطع، صداي سخت آهن قراضه ايجاد مي كند، اين حالت ممكن است با كاهش زاويه كجي تيغه برطرف شود.

 

برش متناوب

اگر زاويه كجي تيغه خيلي كوچك باشد، قالب بوسيله سطح برش فشرده شده و يك مقطع بريده نمي شود، درجه فشردن تا حدي افزايش مي يابد

 كه بافت به طور ناگهاني باز شده و نتيجه آن برش يك مقطع كلفت است. اين حالت ممكن است با زياد كردن زاويه كجي تيغه برطرف شود. جدول صفحه بعد معايب مختلف در موقع برش مقاطع پارافيني را همراه علل و روشهاي برطرف كردن آنها مختصرا شرح مي دهد.

آشغال[2]

وقتي كه در قالب پارافين آشغال ديده شود، قالب گيري بافت در پارافين تازه فيلتر شده ضروري است.

چسباندن مقطع روي لام

در صورتيكه مقطع در حين برش چينهاي مختصري پيدا كرده باشد، بايستي قبل از چسباندن روي لام توسط گرماي مختصري صاف شود. دو روش كه به طور معمول استفاده مي شود در زير توضيح داده مي شود. لام شيشه اي بايستي كاملا تميز شود و بوسيله قلم الماس نام اختصاصي يا شماره قبل از استفاده نوشته شود.

روش حمام آب گرم

يك مقطع بريده شده يا نوار كوتاه مقاطع بايستي به آرامي توسط برس مخصوص يا پنس ريزي بلند شده و در سطح آب گرم در حمام آب گرم قرار گيرد.

 

 درجه حرارت آب بايستي تقريبا 10 درجه كمتر از نقطه ذوب پارافين باشد. وقتي مقطع پهن و كاملا صاف شد، يك لام تميز و عاري از چربي، بطور مورب در داخل آب فرو برده شود تا حد ممكن نزديك مقطع و به آرامي به عقب كشيده بطوريكه سطحش با لبه مقطع تماس پيدا كند.

اسلايد را كه مقطع روي آن چسبيده است كاملا از آب بيرون آورده و توسط نيدل مخصوص مونت كردن مقطع را در وضعيت مناسب روي لام قرار دهيد.

آب اضافي را خشك كرده و لام را براي مدت كمتر از يكساعت به انكوباتور يا صفحه داغ با حرارت 45 تا 50 درجه منتقل كنيد تا مطمئن شويد كه قبل از رنگ آميزي مقطع كاملا خشك شده است.

 

 روش استفاده از صفحه داغ

يك لام تميز عاري از چربي را روي يك صفحه داغ گرم قرار داده و روي آن آب مقطر بريزيد، يك مقطع يا يك نوار كوتاه روي سطح آب قرار داده و چينهاي بزرگ را بدقت با كشيدن پارافين كنار مقطع توسط نيدل مخصوص مونت كردن، صاف كنيد همانطور كه آب گرم مي شود، مقطع پهن مي شود و وقتي كه كاملا صاف شد، لام را از روي صفحه داغ برداشته و آب اضافي را خشك كنيد، به روش قبل مقطع را به حالت مناسب قرار داده و خشك كنيد.

استفاده از مواد چسباننده مقطع

چسباندن مقاطع به لام بوسيله روشهاي فوق منجر به چسبيدن محكم آن مي شود بطوريكه مقطع قادر است چندين مرحله شستن و دستكاريهاي معمول را تحمل كند.

دو عامل مهم كه چسبندگي اش را تحت تاثير قرار مي دهند، عبارتند از اينكه مقطع بايد كيفيت خوبي داشته باشد و لام بايد كاملا عاري از چربي باشد.

معذالك تحت شرايط خاص با وجود روش صحيح چسباندن، ممكن است مقطع بطور ناقص يا كامل در حين رنگ آميزي از لام جدا شود. بعضي از علل جدا شدن مقطع عبارتند از:

غوطه ور ماندن زياد مقطع در محلولهاي قليايي، فيكس كردن بافت در محلولهاي قوي منعقد كننده پروتئين مثل محلول بوئينز، بافتهاي داراي لخته خون يا استخوان.

استفاده از مواد چسباننده در چنين مواردي ترجيح داده مي شود و ممكن است بطور معمول براي تمام مقاطع بكار رود تا مطمئن شويم كه از لام جدا نمي شود. يك چسباننده اي كه خيلي ثابت است مخلوط گليسرول . آلبومين مايراست . سفيده تخم مرغ و گليسرول را به نسبت مساوي مخلوط كرده، توسط يك پارچه فيلتر كنيد و يك گريعتال كوچك تيمول به عنوان نگهدارنده به آن اضافه كنيد.

اين مخلوط به صورت گسترش نازكي روي سطح اسلايد تميز قبل از چسباندن مقطع بوسيله حمام آب گرم يا صفحه داغ كشيده مي شود. بجاي گليسرول- آلبومين از سرم تازه نيز ممكن است استفاده شود.

خمير نشاسته يك چسباننده عالي است ولي بعلت طبيعت كربوهيدراتي اش نمي توان براي مقاطعي كه بروش PAS رنگ آميزي مي شوند، استفاده كرد.

روش تهيه بقرار زير است:

پودر نشاسته                          3 گرم

آب مقطر سرد                         30 ملي ليتر

را مخلوط كرده تا خمير شود و اضافه كنيد به :

آب مقطر در حال جوش                      60 ميلي ليتر

اسيد هيدروكلريك غليظ             5/0 ميلي ليتر

براي 5 دقيقه جوشانده، سرد نموده و 1/0 گرم تيمول اضافه كنيد. پرورش استفاده از مخلوط آلبومين ماير استفاده كنيد.

اضافه كردن يك ماده چسبانده به آب گرم مورد استفاده براي صاف كردن مقاطع هم ساده و هم مفيد است براي اين منظور تركيب زير توصيه مي شود:

دي كرومات پتاسيم                     1درصد در آب مقطر

ژلاتين                                  1درصد در آب مقطر

اينها بايد بصورت محلول غليظ بطور جداگانه نگهداري شده و با غلظت 002/0 درصد از هر كدام به حمام آب گرم اضافه شود.

 

 

دسته بندی : تهیه مقطع

فصل 7

میکروتوم و تیغ های آن

ميكروتوم[1]

ميكروسكوپ زمينه را براي تسهيل مطالعه بافتهاي حيواني بوسيله عبور نور از آنها فراهم مي كند، و براي اين منظور بايستي بافت به ورقه هاي نازك يا مقاطع برش داده شود. با توجه به نوع بافت، مقاطع به ضخامت از پيش تعيين شده بريده مي شوند كه اين ضخامت يكنواخت فقط توسط دستگاهي به نام ميكروتوم فراهم مي شود. ميكروتومهاي مختلف براي محيط هاي مختلف نگهدارنده بافت ساخته شده اند، براي تهيه مقاطع پارافيني معمولاً از انواع راكينگ[2]، چرخان[3]، و لغزشي[4] استفاده مي شود.

 

ميكروتوم راكينگ كمبريج[5]

يك وسيله ارزاني است و با توجه به اينكه حدود يك قرن از ساخت آن مي گذرد، بدليل سادگي استفاده و تهيه مقاطع با كيفيت بالا هنوز در اكثر جاها مورد استفاده قرار مي گيرد. مقاطع بريده شده توسط اين ميكروتوم داراي انحناي مختصري بوده و به اين دليل براي تهيه مقاطع سريالي توصيه نمي شود. يك نوع تغيير يافته از اين، در كريوستات مورد استفاده قرار مي گيرد.

 

 ميكروتوم چرخان:

يك وسيله عالي براي كارهاي تحقيقاتي بوده و اساساً براي تهيه مقاطع سريالي ارزشمند است. برش مقطع بوسيله بلند شدن عمودي و پايين آمدن بافت بر روي لبه تيغ ثابت انجام مي شود، پيشرفت هم آهنگ قالب بوسيله پيچ ميكرومتر و وضعيت اسلايدها كنترل مي شود، حركت عمودي و حركت پيشرفتي در اثر چرخش دستگيره دستگاه ايجاد مي شود.

 ميكروتوم لغزشي

فرق اصلي اين ميكروتوم با ساير مدلها اينست كه در اين نوع قالب بافت ثابت باقي مانده در حاليكه در موقع برش تيه ميكروتوم حركت مي كند. اهميت اصلي اين ميكروتوم اينست كه براحتي از بافتهاي قالب شده در سلوئيدين برش تهيه مي‌كند.

 

 ميكروتوم انجمادي

اين ميكروتوم براي برش مقاطع وقتي بكار مي رود كه:

1- سرعت اهميت زيادي داشته باشد.

2- وقتي كه لازم باشد ساختمان بافت شناسي چربيها نشان داده شود.

3- وقتي كه ساختمانهاي معين عصبي مطالعه شوند.

4- براي بعضي روشهاي هيستوشيمي كه ممكن است مواد در اثر حرارت از بين بروند. در اين دستگاهها با استفاده از گاز co₂ و يا جريان برق بافت و تيغه ميكروتوم تا 20- درجه سانتيگراد سرد مي شوند.

 

  كريوستات[6]

بهترين روش براي تهيه مقطع از بافتهاي فيكس نشده استفاده از كريوستات است، كه شامل يك ميكروتوم بوده كه در يك محفظه با برودت 15- تا 30- درجه سانتيگراد قرار مي گيرد.

اين روش وقتي بكار مي رود كه روش رنگ آميزي آنتي بادي فلورسنت يا روشهاي هيستوشيمي بعضي آنزيمها، مورد توجه باشد.

براي جلوگيري از تشكيل كريستالهاي شكننده بزرگ يخ در حين انجماد بافت تازه، يخ زدن سريع[7] ضروري است.

تيغه هاي ميكروتوم

تيغه ها بر اساس مقطع عرضي شان بترتيب زير طبقه بندي مي شوند:

a)      مقعر يك طرفه[8] : يك فضاي خالي در يك طرف.

b)      فرم گوه اي[9] : دو طرف مسطح.

c)      دو طرف مقعر[10] : در دو طرف سطح خالي.

d)      Tool – edge : دو طرف مسطح با يك بريدگي تيز در لبه.

 هر يك از اين تيغه ها براي هدف خاصي طرح ريزي شده اند، معذالك در عمل آزادي قابل توجهي در استفاده از هر نوع وجود دارد، مشروط بر اينكه تيغه تيز و روي ميكروتوم ثابت باشد، ممكن است بخوبي براي برش اكثر بافتها و مواد قالب شده مورد استفاده قرار گيرد.

تيغه مقعر يك طرفي، با تقعر بيشتر يا كمتر وجود داشته و معمولاً براي بافتهاي قالب شده در سلوئيدين يا پارافين توصيه مي شود. تيغه هاي گوه اي بزرگ براي مقاطع انجمادي، پارافيني و مواد سخت قالب شده در سلوئيدين بكار مي رود، تيغه دو طرف مقعر اساساً براي برش مقاطع پارافيني بكار مي رود و تيغه Tool – edge همراه با ميكروتوم سنگين و قوي براي برش مواد خيلي سخت مثل استخوان دكلسيفيه نشده بكار مي رود. اكثر تيغه ها داراي يك دسته قابل جدا شدن هستند كه در يك طرف بسته مي شود.

 

سطح برش :

در مقطع عرضي اساساً تمام تيغه هاي ميكروتوم گوه اي شكلند، ولي لبه هاي برنده بهمان سرعت نزديك شدن دو لبه گوه، تشكيل يك نقطه را نمي دهند، چون لبه ناشي شده از يك پايه نسبتاً باريك، شكننده بوده و در حين برش مقطع لرزش زيادي ايجاد خواهد شد.

لذا با يك زاويه بازتر از سطح تيغه، كم كم از طرفين باريك شده و لبه واقعي برش را تشكيل مي دهد.

تيز كردن تيغه ميكروتوم

وقتي لبه برنده تيغه ميكروتوم كند شود يا آسيب ببيند، احتياج به تيز كردن دارد.

عمل تيز كردن به دو مرحله تقسيم مي شود، تيز كردن با سنگ[11] و چرم كشيدن[12] كه هر يك از اين كارها ممكن است به صورت دستي يا توسط ماشين تيغ تيزكن اتوماتيك انجام شود. تيز كردن با سنگ باعث خرده شدن فلز از لبه تيغه شده همراه با مواد ساينده، تا زماني كه تمام شكافها از بين بروند و لبه تيغه تيز و صاف شود، چرم كشيدن باعث تميز شدن يا برق شدن لبه تيغه روي مواد نرم تر و معمولا چرم مي شود.

تميز كردن دستي

سنگ تيغ تيزكن يك قطعه چهارگوش از سنگهاي طبيعي يا سنتزي است كه براساس درجه سايندگي به سه دسته زبر[13]، متوسط و نرم تقسيم مي شود. يك سنگ طبيعي با درجه سايندگي متوسط كه در سطح وسيعي مورد استفاده قرار مي گيرد، سنگ زرد بلژيكي[14] است كه در سرعت معقول نتايج خوبي مي دهد.

اندازه سنگ استفاده شده بستگي به نوع تيغه دارد، طولش بايد طوري باشد كه اجازه دهد تمام لبه تيغه در يك مرحله تيز شود، در حاليكه عرض بايد محافظت كافي از هر گونه برخورد تيغه را فراهم كند، تقريبا 20×7 سانتيمتر . قبل از تيز كردن با سنگ بايستي تيغه با زيلن تميز شده و در صورت لزوم به دسته و پشتي لوله اي اش متصل شود.

سنگ روي يك ميز با ارتفاع كافي در جلوي فرد عامل قرار گرفته بطوريكه براحتي بتواند بنشيند، يك پارچه مرطوب در زير سنگ قرار گرفته تا در حين استفاده ، از حركت آن جلوگيري كند، سطح سنگ بايستي تميز شده و تمام آشغال و گردو غبار آن گرفته شود و سپس توسط يك روغن رقيق يا آب صابون آغشته شود.

 

 تيغه در يك طرف سنگ قرار گرفته ( مطابق شكل) و به صورت اريب با هدايت لبه برنده به طرف جلو فشار داده مي شود، بطوريكه تمام لبه به طور مساوي ساييده شود، درست قبل از رسيدن به انتهاي سنگ، بايستي تيغه از روي پشتش برگشته و دوباره توسط لبه برنده اش به طور يكنواخت و مداوم به عقب كشيده شود. فشار وارده به تيغه بايستي به حدي باشد كه لبه را در تماس با سطح سنگ نگه دارد.

تعداد دفعاتي كه تيغه كشيده مي شود بستگي به وضعيت تيغه دارد، ولي تيز كردن زماني كامل مي شود كه تمام شكافهاي بزرگ از بين رفته و لبه راست و تيز باشد، بطوريكه وقتي در زير ميكروسكوپ با بزرگنمايي كم نگاه كنيم دندانه هاي ريز ولي منظم ديده شود، اين دندانه ها مربوط به مواد ساييده شده سنگ است و بوسيله عمل چرم كشي يا براق كردن از بين مي رود.

ساير سنگهايي كه معمولا مورد استفاده قرار مي گيرند عبارتند از :

آركانتراس[15]

يك سنگ طبيعي به رنگ سفيد روشن تا زرد رنگ پريده است. نسبت به سنگ بلژيكي سايش كمتري ايجاد كرده و به همان نسبت عملش آهسته تر است.

آلوكيست[16]

يك سري از سنگهاي مركب بوده كه داراي درجه سايش متفاوت از زبر تا خيلي نرم مي باشد كه فقط انواع نرم و خيلي نرم براي تيز كردن تيغه ميكروتوم مناسبند.

شيشه سنگ[17] ممكن است همراه با يك ساينده مثل اكسيد آلومينيم به عنوان تيغ تيزكن استفاده شود.

اين ساينده به صورت دانه هايي در اندازه مختلف در دسترس بوده كه در آب يا روغن به صورت معلق در آمده و در سطح شيشه سنگ بكار مي رود، كه اين بعدا به صورت سنگ تيزكن معمولي استفاده مي شود.

مزيت اين روش اين است كه بوسيله اندازه هاي مختلف ذرات ساينده، همه نوع تيز كردن انجام مي شود. وقتي كه اين لبه مناسب بوسيله روش سنگ يا شيشه سنگ ايجاد شد، قبل از اينكه مبادرت به چرم كشي شود بايد تيغه كاملا تميز و خشك شود.

چرم كشيدن

روش اين كار شبيه تيز كردن است با توجه به اينكه، تيغه برگشته و به آهستگي روي سطح برنده اش روي يك سطح چرمي به عقب كشيده شده و جلو رانده مي شود.

 چرم ممكن است قابل انعطاف ( آويزان) يا سفت باشد. براي نتيجه بهتر يك چرم خوب مثل چرم اسب توصيه مي شود. كه با استفاده از روغن هاي گياهي كه در زير آن بكار مي رود، نرم نگه داشته مي شود. لعاب چرم كشي داراي مواد ساينده متوسط يا مواد براق كننده بوده و گاهي سرخاب جواهري[18] ممكن است استفاده شود كه اينها به ميزان خيلي كم در سطح چرم به كار مي روند. چرم آويزان در موقع استفاده تا حد امكان بايستي كشيده و سفت شود تا از گرد شدن لبه برنده تيغه جلوگيري كند، چون در غير اين صورت اين حالت ممكن است اتفاق بيافتد.

بكار بردن پارچه كتاني در پشت چرم نتنها به عنوان نگهدارنده عمل كرده، بلكه به عنوان سطح تميزكننده مقدماتي قبل از استفاده از چرم نيز عمل مي كند.

در نوع سفت ضرورتا يك چرم مخصوص روي يك قطعه چوب كشيده شده است، مزيت اين نوع اينست كه تيغه را در حين چرم كشي سفت نگه داشته و در نتيجه احتمال گردشدگي در لبه تيغه را كاهش مي دهد.

بعضي عمل چرم كشي را كاملا ضروري نمي دانند، بخصوص اگر تيغه به طور صحيح با استفاده از مواد ساينده خيلي ريز يا سنگ تيز شود.

معذالك نمي تواند انكار شود كه بدست آوردن لبه هاي خيلي تيز و نگهداري آن براي مدت طولاني روي تيغه ميكروتوم، نه تنها توسط چرم كشي بعد از تيز كردن، بلكه همچنين بعد از هر مرحله برش مقاطع نيز ضروري خواهد بود.

ماشينهاي چاقو تيزكن:

اولين بار در آمريكا مورد استفاده قرار گرفته و قيمت گرانش توسط صرفه جويي در وقت و بكار بردن آن توسط افراد كم تجربه و تهيه كردن تيغه هاي خيلي تيز با لبه يكنواخت جبران مي شود.

در بعضي از اين ماشين ها تيغه به طور دستي در برابر شيشه گردان يا چرخهاي فلزي قرار گرفته و تيز كردن توسط تركيبات سوسپانسيون آلومينايا جوهر الماس كه به طور مداوم پمپ مي شوند، انجام مي گيرد، اندازه ذرات اين سوسپانسيون با توجه به وضعيت تيغه انتخاب مي شود.

مانع بزرگ در استفاده از اين ماشينها اينست كه فشار ناميزان و تغيير در سرعت در حين تيز كردن باعث نامنظم شدن لبه تيغه مي شود و از طرفي تماس بيش از حد تيغه با چرخهاي گردان باعث صدمات زيادي به تيغه مي شود.

اخيرا ماشينهاي ديگري ساخته شده كه تيغه توسط نگهدارنده مخصوص روي صفحه گردان نگهداري مي شود، و صفحه شيشه اي توسط مكانيسم خاصي با سطح برش تيغه تطابق پيدا مي كند.

دسته بندی : تهیه مقطع

فصل 6

پاساژ بافت

تكنيكهاي آبگيري، اشباع سازي و قالب گيري[1] 

انتخاب بافت

بعد از فيكس كردن قطعه‌اي از بافت براي آزمايش بافت شناسي از نمونه بزرگ انتخاب مي‌شود. شرح مختصري از طبيعت بافت و منشاء آن بايد در گزارش كار يا در يك كتابچه ثبت و نگهداري شود. روي يك قطعه مقواي نازك با مداد يا جوهر ضد آب شماره آسيب شناسي بايستي نوشته شود (اين اطلاعات بر طبق سيستم بكار رفته فرق مي‌كند) و در سبد عمل آوردن يا شيشه نمونه همراه بافت قرار گيرد.

قطعاتي كه احتياج به دقت خاص دارند بايستي توسط ستاره روي برچسب مشخص شده و جزئيات مورد توجه در گزارش كار ثبت شود.

غالباً قطعات بافت از سطح خاصي برش داده مي‌شوند، كه اين ممكن است با عبور دادن يك رشته از يك گوشه سطح مقابل بافت كه بايد برش داده شود، مشخص شود.

روش ديگر شامل فرو كردن يك سوزن استيل زنگ نزن نازك يا ريختن يك قطره مركب چين يا يك شكاف V شكل در سطح مقابل مورد برش است.

در هيچ زماني برچسب مشخص كننده بافت نبايد جدا شود. قصور در رعايت اين مسئله ممكن است منجر به گزارشات غلط براي بيماران شود.

روش استفاده از پارافين جامد

آبگيري[2]

محلول فيكس كننده‌اي كه در ابتدا استفاده مي‌شود با پارافين قابل امتزاج نبوده، بنابراين آبگيري مقدماتي لازم است كه براي اين منظور از سه محلول الكل، استون و دي اكسان معمولاً استفاده مي‌شود.

روش استفاده از الكل

اين روش شامل عبور دادن بافت از ظروف الكل متوالي است كه به مرور غلظت آنها افزايش مي‌يابد. بافتها به همراه بر چسب مشخص كننده خود توسط پنس پس از زمان لازم از ظرفي به ظرف ديگر منتقل شده و پس از هر مرحله چند ثانيه بافت توسط كاغذ خشك كن، خشك مي‌شود.

ظروف الكل بايستي پر از سر بطري‌هاي گرد باشد تا قطعات بافت همراه بر چسب در آنها چيده شوند. براي بافتهاي ظريف‌تر از درجه پايين تر الكل استفاده شده و بفاصله خيلي كم بايد درجه الكل افزوده شود.

درجه الكل شروع و زمان لازم براي هر مرحله به نوع و اندازه بافت و فيكس كننده مورد استفاده بستگي دارد. جدول شماره 1 ممكن است تا حدودي بعنوان راهنما مورد استفاده قرار گيرد.

براي اطمينان از اينكه آخرين ظرف الكل، خالص و عاري از آب باشد، لازم است كه يك لايه سولفات مس بدون آب به ضخامت   اينچ در زير كاغذ صافي در ته ظرف قرار گيرد.

اين نمك همچنين بعنوان يك شاخص عمل مي‌كند بطوري كه در حضور آب رنگ آبي ظاهر مي‌شود و در صورتيكه كمترين مقدار رنگ آبي ظاهر شد، بايستي الكل دور ريخته شود. ايزوپروپيل الكل ممكن است براي آبگيري استفاده شود.

 

زمان لازم براي آبگيري در صورتيكه بجاي حرارت اتاق از حرارت 37 درجه استفاده شود ممكن است كاهش يابد.

اين روش در مواردي كه مقطع از قطعه كوچك بيوپسي شده بفوريت لازم باشد، حائز اهميت است. چنين نمونه هايي بايستي قبل از آماده سازي بدقت در كاغذ صافي پيچيده شوند.

 

روش استفاده از استون

اين تركيب براي بيوپسي هاي خيلي فوري بكار فته و فقط قطعات كوچك بافت بايستي تهيه شود. زمان لازم براي آبگيري 5/0 تا 2 ساعت است. بدليل چروكيدگي زيادي كه در بافت ايجاد مي شود، براي كارهاي معمولي مناسب نيست.

روش استفاده از دي اكسان

دي اكسان[3] يك معرف بي نظيري است كه داراي يك ويژگي خاص بوده كه هم با آب و هم با پارافين ذوب شده قابل امتزاج است.

چروكيدگي خيلي جزئي ايجاد كرده و استفاده اش آسان است. اين مزايا با بخار خيلي سمي و قيمت گران اين ماده تحت تاثير قرار گرفته و از طرفي بطور مسلم مقطع براي جدا شدن از پارفين اطرافش مستعد است. دي اكسان بايستي در آزمايشگاه با تهويه خوب استفاده شده و هرگونه باقيمانده آن بايد در داخل سينك ظرفشويي شسته شود.

 

روش كار:

اين روش توسط گراپنروويسبرگ درمورد دي اكسان مورد استفاده قرار گرفته است:

1. ابتدا براي يكساعت در دي اكسان خالص بافت را قرار داده سپس يك ساعت در دي اكسان تازه و نهايتاً 2 ساعت در ظرف ديگر حاوي دي اكسان خالص قرار مي دهيم.
2. بافت را در حمام پارافين اول 15 دقيقه، دوم 45 دقيقه و در ظرف آخري 2 ساعت قرار دهيد.
3. قالب گيري كرده و در آب سرد كنيد.

بعنوان يك روش جايگزين، ممكن است بافت را در يك كيسه توري پيچيده و در يك شيشه دهانه گشاد دي اكسان كه حاوي مقدار جزيي اكسيد كلسيم بي آب است معلق كنيم. دي اكسان آب را از بافت خارج كرده كه توسط اكسيد كلسيم جذب مي شود. آبگيري بسته به اندازه قطعه بافت از 3 تا 24 ساعت طول مي كشد.

 

شفاف كردن[4]

شفاف كردن يا بي الكل كردن اصطلاحي است كه در مورد خارج كردن الكل

از بافت يا مقطع بوسيله فرو بردن آن در يك محيط حد واسط ديگر[5] بكار مي رود. بيشتر اين محيط هاي حد واسط اصلي، ضريب انكسار نور بافت بدون الكل شده را افزايش مي دهند، و بواسطه اثري كه در ترانس پرانس در اين مرحله ايجاد مي شود به نام مرحله شفاف كردن گفته مي شود و محلول بكار رفته بعنوان عامل شفاف كننده عمل مي كند.

چون تمام محيط هاي واسط موجود امروزي (مثل كلروفوم) باعث ترانس پرانس نمي شوند، لذا كاربرد لفظ شفاف كردن بطور اكيد، صحيح نيست.

ماده شفاف كننده بايد با الكل و پارافين قابل امتزاج باشد، معمولي ترين مواد شفاف كننده شامل زيلين[6] ، تولوئن[7] ، كلروفوم و روغن سدر[8] مي باشد.

 

زيلين

يك شفاف كننده سريع و مناسب براي بيوپسي هاي فوري است. ارزان و خيلي قابل اشتعال است. بافت بوسيله زيلن ترانس پرانس شده و بسهولت در آون پارفين تبخير مي شود. اگر ضخامت بيوپسي و قطعات بافت بيش از 3 ميليمتر نباشد، در عرض 15 تا 30 دقيقه شفاف مي شود. ولي بعضي مواد، بطور قابل ملاحظه اي مغز و بافتهاي حاوي خون در صورتيكه مدت طولاني در زيلن قرار گيرند، ترد و شكننده مي شوند.

 

تولوئن

اين بخاطر سميت كمترش بعنوان Anti - medium  جانشين بنزن در كارهاي معمولي شده است. مثل زيلن خيلي قابل اشتعال با خاصيت شفاف كنندگي مشابه، ولي بدون اثر شكنندگي روي بافت مي باشد. نسبت به زيلن كمي گرانتر است و زمان لازم براي شفاف كردن از 15 تا 180 دقيقه بسته به نوع و ضخامت بافت تغيير مي كند.

 

كلروفرم[9] 

يك ماده شفاف كننده گران ولي مشهور است، كه قابل اشتعال نبوده و حداقل چروكيدگي يا سختي را در بافت ايجاد مي كند، حتي زماني كه مدت شفاف كردن بيش از حد لازم باشد. بطور آهسته در بافت نفوذ كرده و جانشين الكل شده و ترانس پرانس در آن ايجاد نمي كند بطوريكه تشخيص زمان اتمام كار مشكل است.

اكثر بافتهاي با ضخامت 3 تا 5 ميليمتر در عرض 6 تا 24 ساعت الكل شان خارج مي شود. بايستي خاطر نشان كرد كه بخار كلروفرم هم بيهوش كننده است و هم سمي و همچنين ممكن است روي واشر لاستيكي ظروف اشباع سازي در خلاء اثر سوء داشته باشد.

روغن سدر[10]

بخاطر قيمت گران و عمل آهسته اش ندرتاً بعنوان شفاف كننده معمولي بكار مي رود. اين ماده حتي به بافتهاي خيلي ظريف يا صدمه وارد نمي كند يا خيلي كم صدمه مي زند و لذا بدليل اهميت خاصش در آزمايشگاه هاي تحقيقاتي و انجام كارهاي جنين شناسي بكار مي رود.

بافتهاي معيني مخصوصاً پوست و بافتهاي حاوي الياف متراكم، با اين ماده تهيه مي شوند چون بدليل استحكام و قوانم اين بافتها، برش مقطع تسهيل مي شود و بعد از جانشيني الكل قطعه بافت ترانس پرانس مي شود. ولي روغن بسختي در آون پارافين از بين مي رود و چندين تعويض پارافين ضروري مي باشد. در روش ديگر بافت شفاف شده ممكن است مدت 30 دقيقه در تولوئن قرار گيرد و بعد به پارافين مذاب منتقل شود. روغن سدر بكار رفته براي بافت شناسي يك مايع رقيق، بي رنگ تا حدودي زرد و غير از نوع خيلي لزج و چسبنده است كه براي ايمرسيون اسلايد بكار مي رود كه براي خارج كردن الكل مناسب نيست.

ساير مواد

دي سولفيد كربن، تتراكلريد كربن، روغن پارفين، سلوزولو (دو – اتوكسي اتانل) و متيل بنزوات خيلي كم بعنوان Anti – medium بكار مي روند.

معذالك، متيل بنزوات سلوئيدن را حل كرده و همراه آن براي اشباع سازي دوباره اجسام سخت يا شكننده استفاده مي شود.

اشباع سازي با پارفين

بافتها از ماده شفاف كننده به حمام پارافين مذاب در آون قالب گيري[11] منتقل مي شوند

طي اين مرحله ماده شفاف كننده بوسيله نشت در پارافين مذاب اطراف از بافت خارج شده و پارفين بداخل بافت نفوذ كرده و جانشين آن مي شود. حداقل يك تعويض پارفين بايستي انجام شود. براي اطمينان از خارج شدن ماده شفاف كننده و جابجايي با پارافين خالص تعداد دقيق تعويض پارافين و زماني كه بافت در هر كدام آنها باشد. بستگي به قوام و اندازه بافت و ماده شفاف كننده مورد استفاده دارد.

 جدول شماره2 راهنماي مناسبي براي زمان لازم اشباع سازي براي اكثر بافتهاست.

 

 پارافين مورد استفاده بايد داراي نقطه ذوب مناسب باشد، كه اين بسته به نوع بافت فرق مي كند، بافتهاي سخت احتياج به پارفين با نقطه ذوب بالاتر نسبت به بافتهاي نرم دارند تا قوام و نگهداري لازم در حين برش مقطع بوجود آيد.

پارفيني كه معمولاً استفاده مي شود داراي نقطه ذوب بين 50 تا 60 درجه است. مشهورترين نوع براي اكثر مواد جراحي و بيوپسي شده داراي نقطه ذوب 56 درجه است.

براي توليد مقاطع خوب، نفوذ كامل پارافين ضروري است ولي اگر بافت طي اين مرحله در معرض پارافين با حرارت بالاتر از اين حد قرار گيرد، ممكن است سختي زيادي ايجاد شود كه باعث اشكالاتي در برش مي شود.

به عبارت ديگر نفوذ نامناسب منجر به خشكي نهايي و چروكيدگي قطعه بافت قالب گيري شده مي شود كه در اثر نگهداري نامناسب توسط پارافين در مواقع برش مقطع ترك خورده يا خرد مي شود. آون نفوذ پارافين محفظه اي است كه بطور الكتريكي گرم شده و ممكن است داراي يك پوشش آب باشد و يا بدون آب، همچنين واجد يا فاقد تهويه باشد.

يك ترموستات قابل اعتماد بايستي درجه حرارت داخل را 2 تا 3 درجه بالاتر از نقطه ذوب پارافين نگهدارد. فضاي داخل آون بايد به اندازه اي باشد كه يك ظرف لعاب دار وقيف كه توسط كاغذ صافي واتمن نمره يك پوشيده شده جهت فيلتر كردن پارافين تازه يا استفاده شده و تعدادي ظرف شيشه اي در اندازه مناسب براي نفوذ پارافين در بافت، در آن قرار بگيرد.

بعضي آونها كه بطور خاص ساخته مي شوند داراي يك ساختمان فوقاني جداگانه براي قرار دادن ظروف لازم جهت نفوذ پارافين در بافت مي باشد كه توسط يك درب لولايي بسته مي شود و لذا تمام فضاي داخل آون براي فيلتر كردن و ذخيره پارافين اختصاص مي يابد.

اخيراً ذخيره و توزيع پارافين مذاب توسط توزيع كننده هاي[12] جديد كه توسط جريان برق گرم شده و حرارت آن قابل كنترل بوده و داراي يك محفظه اي به ظرفيت 5/4 ليتر (يك گالن) با يك فيلتر در دريچه خروجي، نوك گرم و دربي كه براحتي بسته مي شود، تسهيل گرديده است.

درجه حرارت بيش از 70 درجه تنظيم شده و داراي يك وسيله ايمني قطع كننده در 90 درجه است كه از داغ شدن زياد و خطر آتش سوزي جلوگيري مي كند. اين وسيله فقط براي پارافين تازه بكار مي رود مگر اينكه يك فيلتر اضافي مناسب براي پارافين استفاده شده روي آن نصب گردد.

قوام بافت[13]

بافتهاي متراكم (سخت) احتياج به زمان بيشتري براي اشباع سازي در پارافين مذاب داشته تا از نفوذ كامل آن اطمينان حاصل شود و بنابراين ساختمانهايي شبيه استخوان، فيبروما و مغز تقريباً به زماني 2 برابر بافتهاي نرم مثل كليه و كبد احتياج دارند. سختي بيش از حد بافتهاي سخت در اثر افزايش زمان قرارگرفتن در پارافين داغ (به استثناي مغز و ساير مواد C.N.S ) ممكن است در حين برش مقاطع مشكلاتي ايجاد كند.

نفوذ كامل پارافين در چنين بافتهايي بدون ايجاد سختي بيش از حد، مي تواند توسط روش اشباع سازي در خلاء انجام گيرد.

 

اندازه قطعه بافت

مقدار ماده شفاف كننده كه به پارافين منتقل مي شود بستگي به ميزان سطح قطعه بافت دارد. وقتي كه قطعات بزرگ را آماده مي كنيم با تعويض مكرر پارافين، اثر اين آلودگي ممكن است به حداقل برسد. زمان لازم براي نفوذ كامل پارافين بستگي به ضخامت بافت داشته براي مثال يك قطعه به ضخامت 5 ميلي متر حدود سه ساعت وقت لازم داشته در حاليكه براي يك قطعه به ضخامت 10 ميلي متر ممكن است اين زمان به 10 ساعت برسد.

 

آماده سازي اتوماتيك بافت

دستگاه آماده سازي اتوماتيك بافت مثال خوبي از كاربرد عملي اتوماسيون در آزمايشگاه پزشكي است اين دستگاه ها زمان و كار لازم براي آماده سازي بافت را كاهش داده و بموجب آن امكان تشخيص سريع تر فراهم شده در حاليكه كاركنان آزمايشگاه وقت آزادتري براي انجام كارهاي تكنيكي دارند. سرعت عمل و كاهش زمان آماده سازي بعلت تكان دادن دائمي بافت بوده كه در نتيجه باعث نفوذ بهتر مواد و ايجاد نتيجه بهتري مي شود.

انواع مختلفي از اين ماشينها براي استفاده در آزمايشگاه ساخته شده كه در اينجا مدل روميزي [14] شرح داده مي شود.

بدنه از فايبر گلاس، صفحه محفظه ها و درپوش دستگاه از مواد پلاستيكي چندلايه مقاوم و نفوذناپذير به مواد شيميايي ساخته شده اند. بدنه روي يك استوانه سوار شده و اجازه مي دهد كه سكو چرخيده و دسترسي راحت به محفظه ها و حمام هاي پارافين فراهم شود.

 

ظروف آزمايش و حمام هاي پارافين

دستگاه براي 12 مرحله جداگانه بافت در نظر گرفته شده كه 10 ظرف شيشه اي و 2تا داراي حمام پارافين با حرارت قابل كنترل هستند. محفظه ها داراي يك ليتر حجم بوده، بدون لبه كه براحتي در زي صفحه پلاستيكي درپوش جفت شوند. حمام هاي پارافين توسط يك سيم سه شاخه به دستگاه وصل شده كه براحتي برداشته شده و روي ميز آزمايشگاه براي قالب گيري قرار مي گيرند.

بازوي انتقال دهنده

 

بازوي انتقال دهنده كه بافت را در بين محلولهاي آماده كننده حركت مي دهد با تعدادي از واحدهاي مكانيكي جداگانه كار مي كند.

توسط يك حركت دكمه از مكانيسم گرداننده جدا شده و در نتيجه مي توان بطور دستي بافت را در هر نقطه از سيكل آماده سازي قرار داد.

 

تكان دادن[15]

اين حالت بوسيله يك حركت عمومي مداوم فراهم مي شود. اين حركت بوسيله مكانيسم خاصي از طريق بازوي انتقال دهنده به محفظه حاوي بافت منتقل مي شود.

 

واحد تعيين زمان

اين قسمت ضرورتاً شامل يك ساعت الكتريكي است كه به يك صفحه فلزي علامتدار 24 ساعته با تقسيمات 15 دقيقه اي متصل است. در خارج هر درجه صفحه لغزنده وجود داشته كه بوسيله كليد مخصوصي بالا و پايين مي رود. (جدول 3)

 

قالبهاي مخصوص قالب گيري بافت

اين قالبها شمال انواع مختلفي هستند كه عبارتند از:

جعبه هاي قالب گيري لوكهارد[16]

اينها قالبهاي مناسبي براي كارهاي معمولي بوده و در سطح وسيعي استفاده مي شوند. اينها شامل دو قطعه فلزي L شكل در اندازه هاي مختلف هستند. در موقع استفاده روي يك صفحه فلزي يا شيشه اي قرار گرفته و قالبها را در اندازه دلخواه مي سازند.

 وقتي پارافين قالبگيري سفت شد،

 قالب همراه بافت از روي كف برداشته

 شده و روي ميز قرار مي گيرد و دو

 تكه L شكل بلافاصله از قالب جدا

 شده و دوباره مورد استفاده قرار

مي گيرند. (شكل مقابل)

 

 

قالب پلاستيكي يخ

اينها براي آزمايشگاه هاي شلوغ مناسب بوده كه در هر قسمت يك بافت قالب گيري شده و وقتي كه سفت شد با كج كردن قالب پلاستيكي براحتي از آن جدا مي شود. اين حالت ممكن است با كشيدن يك لايه گليسرين يا پارافين مايع در داخل قالب تسهيل شود.

شيشه ساعت

اينها براي بيوپسي هاي تكه تكه ايده آل هستند، در عين اينكه كشيدن لايه گليسرين در داخل قالب لازم نيست. البته چون گاهي قالب بسختي جدا مي شود اين احتياط لازم است.

كشتي كاغذي

اين قالبها شبيه شكل زير ساخته مي شوند. مزيت اينها اينست كه هم ارزان بوده و هم اينكه قطعه بافت همراه قالب نگهداري مي شود ولي براي كارهاي معمول آزمايشگاهي مناسب نيست. يك روش مفيد براي مشخص كردن جهت قطعه بافت در قالب پارافيني اينست كه توسط قلم سربي نرم يك خط در سطح داخلي كف قالب بكشيم، وقتي كه قالب پارافين از قالب جدا مي شود، خط براحتي در روي آن ديده مي شود و جهت بافت را مشخص مي كند.  

حلقه هاي پلاستيكي قالب گيري

اين يك محصول جديد يكبار مصرف است كه در اندازه هاي مختلف و براي سرعت زياد در روش استفاده از پارافين مورد استفاده قرار گيرد. .

اين حلقه ها همراه با صفحات كف استيل زنگ نزن مخصوص بكار مي روند. بافتي كه قالب گيري مي شود توسط موادي كه روي صفحه كف پاشيده مي شود، حالت داده شده و حلقه پلاستيكي روي آن قرار گرفته و پارافين مذاب آنقدر ريخته مي شود تا لبه حلقه برسد.

بعد از سرد كردن قالب، كف براحتي جدا شده و بافت قالب شده براي برش آماده است. احتياج به اصلاح قالب نبوده و حلقه پلاستيكي خود بعنوان نگهدارنده قالب عمل مي كند.

بعد از برش دادن نيز قالب در حلقه پلاستيكي نگهداري مي شود. اين روش يقيناً در وقت تكنسينها تا حد زيادي صرفه جويي كرده و وقتي كه قالب دوباره برش داده شود نيز ارزشمند است.

 ولي عيبش اينست كه احتياج به فضاي بيشتري براي نگهداري داشته و قيمت آنها نيز گران است.

لوله هاي شيشه اي

لوله هاي شيشه اي كه يك طرفشان با چوب پنبه بسته شده براي قالب گيري نمونه هاي سلول شناسي كه بايد برش داده شوند، مفيد است.

آماده سازي و قالب گيري در لوله انجام شده و نمونه ممكن است بين هر دو مرحله سانتريفوژ شود. قطعات كوچك بافت كه در ته لوله جمع خواهد شد مقطع گيري را ساده تر خواهد نمود.

بعد از سفت شدن پارافين چوب پنبه خارج شده و قالب از لوله خارج مي شود.

روش قالب گيري

1- كف قالب را با پارافين مذاب كاملاً پر نماييد.

2- يك پنس را كه نوكش گرد باشد گرم كرده و بافت را از حمام پارافين به قالب منتقل كنيد.

3- دوباره پنس را گرم كرده و جهت بافت را بطور دلخواه تنظيم كنيد و پنس گرم را در اطراف بافت چرخانده تا تمام پارافين جامد كه در حين انتقال از حمام پارافين به قالب منتقل شده ذوب شود. و سپس قالب را از پارافين مذاب كاملاً پر نماييد.

4- برچسب مربوطه را از حمام پارافين خارج كرده و در سطح ديگر قالب نزديك بافت قرار دهيد.

5- آنقدر به سطح قالب فوت كنيد تا يك لايه از پارافين جامد شود.

6- قالب را به يك ظرف آبسرد منتقل كرده و فوراً در آن غوطه ور نماييد. قالب بايد آنقدر در آب فرو برده شود تا پارافين سخت شود.

كه ممكن است 10 تا 30 دقيقه بطول بيانجامد، ولي سفت شدن پارافين ممكن است با انتقال قالب به آب جاري تسريع شود.

قالب گيري با ژلاتين

بطور معمول بافتي كه براي مقاطع انجمادي تهيه مي شود احتياج به قالب گيري ندارد، چون انجماد سختي لازم را در بافت ايجاد كند.

ولي وقتي بافتهاي سخت پي مانند يا قابل اشتعال بايد به روش انجماد برش داده شوند، بهتر است كه بافت در يك محيط نگهدارنده قالب گيري شود تا از ريزش بافت جلوگيري كند.

محيط معمول براي قالب گيري براي اين منظور ژلاتين است كه وقتي بافت قالب شده را به فرمالين منتقل كنيم سخت مي شود. فرمالين ساختمان ژلاتين را از هيدروسول به هيدروژل تبديل مي كند.

روش قالب گيري ژلاتيني آشوف[17]

روش تهيه

محلول 1 و2: آب مقطر را تا 37 درجه گرم كرده و فنل را حل كنيد، ژلاتين را اضافه نموده و در انكوباتور 37درجه قرار دهيد تا محلول عمل آيد.

بوسيله يك گاز جراحي فيلتر نموده، داخل شيشه ريخته و برچسب بزنيد.

محلول3: فرمالدهايد غليظ را به آب مقطر اضافه كنيد، خوب مخلوط نموده و برچسب بزنيد.

آماده كردن براي استفاده

ژلاتين را در حمام آب گرم يا انكوباتور ذوب كنيد.

 

روش كار

1- بافتي كه در فرمالين فيكس شده و بيش از 3 ميليمتر ضخامت ندارد، شسته و در ژلاتين در حرارت 37درجه براي 12 تا 24 ساعت در انكوباتور قرار دهيد.

2- براي 12 تا 24 ساعت به محلول شماره 2 با حرارت 37 درجه منتقل كنيد.

3- با استفاده از جعبه هاي قالب گيري[18] در محلول 2 قالب گيري نموده و سپس سرد و اصلاح كنيد. ژلاتين اضافي از يخ زدن جلوگيري مي كند.

4- قالب اصلاح شده را براي 24 ساعت در محلول 3 قرار دهيد و سپس بوسيله مقاطع انجمادي برش دهيد.

توجه: بعد از قالب گيري قالب ژلاتيني ممكن است در يخچال سرد شود ولي نبايد يخ بزند. ژلاتين زيادي ممكن است با قراردادن قالب روي كاغذ توسط قيچي اصلاح شود. بافت آماده شده توسط ژلاتين نسبت به بافت هم اندازه خود ديرتر يخ مي زند. با استفاده از اين روش مقاطعي با ضخامت بيش از 5 ميكرون مي توان تهيه نمود.

سلوئيدين[19]

سلوئيدين نام تجارتي فرم خالص نيتروسلولز است. براي برش بافتهاي سخت با قوام مختلف، براي برش مقاطع خيلي ضخيم و يا وقتي كه حداقل چروكيدگي مد نظر باشد و مقاطع انجمادي عملي نباشد، بعنوان محيط قالب گيري بافت شناسي حائز اهميت است.

سلوئيدن معمولاً بصورت پشم مرطوب شده با الكل بكار مي رود، غلظت كاربردي اش بصورت 2 و 4 و 8 درصد بوده و حلالش محلول مساوي الكل و اتر است.

نسول (نسلوئيدين) تركيب مشابهي از مركز دارويي انگليس است كه در اكثر آزمايشگاه ها بجاي سلوئيدن بكار مي رود. بصورت محلول 8 درصد در دسترس بوده كه براي استفاده بايد تا تا 16 درصد تغليظ شود. براي تغليظ محلول را در يك قفسه قرار داده تا تبخير شده و حجمش به نصف برسد.

تبخير مشكل هميشگي در رابطه با استفاده و كاركردن با محلولهاي سلوئيدن است و بايستي هميشه در بطريهاي درب بسته نگهداري شود.

بطري ايده آل براي اينكار شيشه هاي روغني دهان گشاد است كه علاوه بر درب شيشه اي كلفت داراي درپوش گيره اي نيز هست. بايد يادآور شد كه بخار اتر خيلي خطرناك بوده و سلوئيدن هرگز نبايد در مجاورت شعله استفاده شود.

 

اشباع سازي و قالب گيري با سلوئيدين

اشباع سازي

1- بافت را با افزودن درجه الكل آبگيري نماييد، براي تكميل آبگيري از يك طرف الكل خالص حاوي سولفات مس استفاده كنيد.

2- براي 24 ساعت بافت را به مخلوط مساوي اتر – الكل منتقل كنيد، هدف از انجام اين مرحله تسريع مرحله اشباع سازي بعدي است.

3- بافت را براي 5 تا 7 روز به محلول رقيق (2درصد) سلوئيدين منتقل كنيد.

4- بافت را براي 5 تا 7 روز به محلول متوسط (4درصد) سلوئيدين منتقل كنيد.

5- بافت را براي 5 تا 7 روز به محلول غليظ (8درصد) سلوئيدين منتقل كنيد.

قالب گيري

1- قالب مناسب را از محلول غليظ (8درصد) سلوئيدين تا نيمه پركرده و بافت را طوري در آن قرار دهيد كه سطح مورد برش در بالا قرار گيرد. توسط محلول قالب را پر نمائيد. قالب بايد بطور قابل توجهي گودتر از ضخامت بافت باشد تا از بيرون زدگي و نمايان شدن بافت جلوگيري كند، همچنين سلوئيدين موقع سفت شدن چروك مي خورد. كشتي هاي كاغذي براي اينكار ايده آل هستند.

2- قالب را در دسيكاتور حاوي بخار اتر قرار دهيد تا تمام حبابهاي هواي آن خارج شود. بلافاصله بعد از خارج شدن حبابهاي هوا از محيط قالب بافت را وارونه كنيد بطوريكه سطح قابل برش در پايين قالب قرار گيرد، اين حالت از ورود حبابهاي هوا در زير بافت جلوگيري مي كند.

3- قالب را به ديسكاتور ديگر حاوي بخار كلروفرم منتقل كرده تا زماني كه سلوئيدن به ميزان لازم سفت شود، كه اين حالت با فشار دادن انگشت روي سطح قالب مشخص مي شود، بطوريكه هيچ اثري از فشار انگشت روي آن باقي نماند.

4-بافت قالب شده را از قالب جدا و در كلروفرم خالص قرار دهيد كه در ابتدا شناور بوده ولي نهايتاً در كف ظرف فرو مي رود.

وقتي كه بافت قالب شده فرو رفت، به محلول 70درصد الكل منتقل نموده تازماني كه برش دادن لازم باشد. بجز سطح مورد برش، بقيه سطوح حالا ممكن است اصلاح شود.

متصل نمودن قالب به نگهدارنده

قالب سلوئيدين به نگهدارنده هاي چوبي يا گوگردي كه دندانه هاي عميقي در آنها ايجاد شده متصل مي شود. نگهدارنده قالب با سلوئيدين متوسط (4درصد) پوشيده شد و قالب اصلاح شده محكم بداخل آن فشار داده مي شود.

فشار بوسيله قرار دادن يك وسيله سنگين يا پيچيدن يك نوار دور نگهدارنده و قالب حفظ مي شود.

بعد از حدود يكساعت، در حين اينكه قالب و نگهدارنده مي تواند به ديسكاتور حاوي كلروفرم برگردانده شوند، سلوئيدين سفت شده و قالب و نگهدارنده براي 30 دقيقه به الكل 70درصد منتقل مي شود. سطح مورد برش حالا ممكن است توسط يك تيغ دستي اصلاح شود.

روش معمول اين است كه قالب و نگهدارنده تا زماني كه تمام كارهاي لازم روي مقطع انجام شود، در الكل 70درصد نگهداري شود. قالبهاي چوبي بايد از چوبهاي ساخته شده و قبل از استفاده بايستي خيسانده شود تا مطمئن شويم كه تغيير رنگي در الكل و قالب ايجاد نمي شود.

در بسياري از آزمايشگاهها كلروفرم براي سخت كردن بافت استفاده نمي شود. سخت كردن خيلي به آهستگي بوسيله قرار دادن قالب در زير  يك استوانه زنگ كه يك طرف آن براي خروج بخار بالا قرار مي گيرد انجام شده و با خروج بخار محلول غليظ مي شود.

وقتي كه از اين روش استفاده مي شود، لبه استوانه زنگ كه بالاست بايد بطور دوره اي عوض شود تا مطمئن شويم كه بخار بطور كامل خارج شده و در طول شب يا تعطيلات آخر هفته پايين آورده شود.

نسول نيز به همين روش استفاده شده ولي محلول نفوذ كننده اش از نظر غلظت دوبرابر است بصورت 4 و 8 و 16 درصد بافت در محلول غليظ قالب گيري شده و همانطور كه شرح داده شد، غليظ مي شود.

 

نيتروسلولز با ويسكوزيته پايين (L.V.N)

بوسيله بعضي افراد بعنوان محيط قالب گيري استفاده شده و برتر از سلوئيدين است. برتري اش اينست كه يك قالب سفت تر نسبت به سلوئيدين ساخته و تهيه مقاطع نازكتر ممكن مي شود.

در مقاطعي مستعد به ترك خوردن و شكستن هستند با اضافه كردن مواد پلاستيكي به اين محيط، اين عيب بر طرف مي شود. اضافه كردن 5/0 درصد رزين اولئوم (روغن كرچك) براي قالب گيري بافتهاي با رنگ ثابت توصيه مي شود. كه در زير  شرح داده مي شود:

 

روش تهيه

L.V.N را در الكل و اتر حل كرده و رزين اولئوم را اضافه نموده خوب هم زده و برچسب بزنيد.

روش كار

1- بافت را به روش سلوئيدين آبگيري كنيد.

2- براي مدت 4 تا 7 روز در محلول شماره يك قرار دهيد.

3- براي مدت 4 تا 7 روز در محلول شماره دو قرار دهيد.

4- در محلول شماره 3 قالب گيري نموده و بر طبق روش سلوئيدين ادامه دهيد.

توجه: مقاطع بايد خشك بريده شده و در الكل 70 درصد جمع آوري شوند. L.V.N خيلي قابل اشتعال بوده و بايد با احتياط كار نموده و از تابش مستقيم نور خورشيد بايد محافظت شود.

روش دوبار اشباع سازي پترفيت[20]

اين روش براي تهيه مقطع از قالبهاي بافتي كه داراي استحكام متفاوت است (مثل چشم) كمك خوبي مي نمايد.

سلوئيدين خشك                                1 گرم

متيل بنزوات                               100 ميلي ليتر

سلوئيدين خشك را وزن كرده و به يك ظرف 250 ميلي ليتري منتقل كنيد.

متيل بنزوات را اضافه نموده و درب آنرا محكم ببنديد. هر روز چند بار تكان دهيد و گاهي ظرف را وارونه نماييد تا محلول سلوئيدين آماده شود.

روش كار

1- طبق روش معمول آبگيري نماييد.

2- بافت را از الكل خالص به محلول متيل بنزوات – سلوئيدين منتقل كرده و براي 24 تا 72 ساعت در آن قرار دهيد.

3- از سه تعويض تولوئن در عرض 24 ساعت عبور دهيد.

4- بر طبق روش معمول با پارافين جامد اشباع سازي نموده و قالب گيري كنيد.

توجه: تغييرات زيادي در روش فوق ممكن است ايجاد شود، بعضي قبل از اشباع سازي با محلول سلوئيدين، در متيل بنزوات شفاف مي كنند، عده اي براي 24 ساعت در محلول ثانوي داراي 2درصد سلوئيدين در متيل بنزوات اشباع مي كنند.

زمان باقي گذاشتن در تولوئن نيز توسط بعضي كاهش مي يابد.

دسته بندی : تهیه مقطع